Immobilized enzyme microreactors in drug metabolism research

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-6924-2
Title: Immobilized enzyme microreactors in drug metabolism research
Author: Kiiski, Iiro
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Pharmacy, Division of Pharmaceutical Chemistry and Technology
Doctoral Programme in Drug Research
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2021-02-12
Belongs to series: URN:ISSN:2342-317X
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-6924-2
http://hdl.handle.net/10138/324276
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Drug metabolism is an enzyme-catalyzed process that has major implications for a drug’s safety and efficacy. Consequently, evaluating the metabolic properties of a new drug candidate is of paramount importance already in the preclinical phase of drug development. Although the available in vitro techniques for drug metabolism research have improved over recent years, the state-of-the-art methodology relies on enzyme assays conducted in static conditions, with limited spatiotemporal control of assay variables. Conducting metabolic assays under flow-through conditions could pave the way for more in-depth understanding of the mechanistic basis underlying drug-enzyme and drug-drug interactions. This, however, requires that drug-metabolizing enzymes be immobilized onto a solid support material without compromising protein folding or enzyme function. Although a wealth of different enzyme immobilization strategies are currently available, most of them are not amenable to immobilization of the microsomal, drug-metabolizing enzymes. The aim of this thesis was to establish immobilized enzyme microreactor (IMER) platforms for studying drug metabolism under flow conditions, thereby improving the in vitro-in vivo prediction of the metabolic fate of new drug candidates. The use of microfluidics and microfabrication technology facilitated the straightforward implementation of flow-through assays and furthermore allows their multiplexing (parallelism) and integration with other operational units on a single platform, minimizing both reagent consumption and dead volumes. In the first sub-project (publication I), a novel strategy for the immobilization of the membrane-bound enzymes cytochrome P450 (CYP) and UDP-glucuronosyltransferase (UGT) was designed and implemented on microreactors fabricated from off-stoichiometric thiol-enes (OSTE). The strategy was based on biotinylation of human liver microsomes via biotin-tagged fusogenic liposomes, and utilized the tunable surface chemistry of OSTEs to allow easy functionalization of the microreactor surface. The IMER platform was preliminarily characterized to ascertain enzyme stability and preservation of key enzyme kinetic parameters, with an emphasis on CYP-mediated (phase I) oxidoreductive reactions. In the second sub-project (publication II), the feasibility of the IMER platform for studying the kinetics of UGT-mediated drug conjugation (phase II) was assessed, with an emphasis on the mechanistic basis for the pronounced underestimation of in vivo clearance kinetics by the currently available static in vitro techniques. In particular, the effect of membrane disruption and fatty-acid inhibition on UGT-kinetics in vitro was studied in detail. The kinetics of zidovudine glucuronidation (the model reaction used in this study) under flow-through conditions was shown to be in good agreement with that obtained using microsomal incubations in static conditions without the need for added pore-forming agents such as alamethicin. In the third sub-project (publication III), the technology was further developed by incorporating a highly overlooked dimension in the assay design: the impact of oxygen partial pressure on the metabolic fate of drug candidates. This was achieved by exploiting the unique material-induced oxygen scavenging property of thiol-ene polymers. The developed chip design allowed the rapid and simple control of oxygen concentration in enzymatic assays, which is difficult to achieve with conventional static assay methods. Overall, the developed methodology was shown to retain enzyme activity and native enzyme kinetic parameters of both CYP and UGT enzymes, an unconditional prerequisite for drug metabolism assays. With the immobilization method utilizing membrane biotinylation via liposome fusion, common problems (such as diffusion-limited kinetics and enzyme inactivation) associated with conventional immobilization approaches were circumvented. Furthermore, the universal applicability of the immobilization method for all membrane-bound enzymes was preliminarily demonstrated with recombinant CYP enzymes in sub-project/publication I. The methodology developed here also enabled mechanistic studies focused on the alamethicin-induced membrane disruption (commonly used in UGT assays to overcome mass transfer limitations) and the proposed inhibitory effects of fatty acids, which may shed light on the foundations behind the poor in vivo correlation associated with UGT reactions in vitro. The material-induced oxygen scavenging facilitated by OSTE polymers, together with microfluidic actuation, was shown to be an easily controllable approach for adjusting the oxygen partial pressure on demand. The advantage of this approach is that, unlike in typical approaches, complex chip designs or pressurized compartments are not needed. Beyond the demonstrated feasibility of the IMER platform for studying the impact of NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase (POR)-mediated metabolism, the theoretical framework established here for OSTE-enabled oxygen control in microfluidic assays is likely to find many applications, particularly in organ-on-a-chip research. In conclusion, the microreactor platform developed in this thesis offers an enabling toolbox for conducting in vitro drug metabolism assays under flow conditions that circumvents many of the key shortcomings of current state-of-the-art (static) in vitro enzyme assay methodology, as well as those of previously reported IMER platforms. At the time of publication, the methodology developed herein has already been utilized in several follow-up studies and has shown utility in diverse applications beyond this work.Lääkeainemetabolia on entsyymivälitteinen prosessi, jossa elimistö muokkaa lääkeaineita helpommin eritettävään muotoon. Lääkeainemetabolialla on suuri merkitys sekä lääkkeen turvallisuuden että tehon kannalta. Tästä syystä uuden lääkeaineen metaboliaa on ensiarvoisen tärkeää kartoittaa jo lääkekehityksen varhaisessa, prekliinisessä vaiheessa. Vaikka lääkeainemetabolian tutkimiseen käytetyt in vitro -menetelmät ovatkin kehittyneet viime vuosina, on kokeellisten parametrien säätö ajan ja paikan suhteen haastavaa nykyisillä staattisilla kuoppalevymenetelmillä. Metaboliakokeiden suorittaminen virtausolosuhteissa voisi auttaa tutkijoita lääke-entsyymi- ja lääke-lääke-yhteisvaikutusten mekanismien ymmärtämisessä. Virtausolosuhteiden hyödyntämiseksi lääkeaineita metaboloivat entsyymit pitää kuitenkin kiinnittää eli immobilisoida kiinteään kantajamateriaaliin. Immobilisointi ei saisi kuitenkaan muuttaa entsyymin aktiivisuutta tai lääkkeen ja entsyymin välisten vuorovaikutusten voimakkuutta. Vaikka entsyymien immobilisointiin on tarjolla runsaasti eri menetelmiä, useimmat niistä soveltuvat huonosti solukalvoon sitoutuneille entsyymeille, joihin kuuluvat myös tärkeimmät lääkeaineita metaboloivat entsyymit, sytokromi P450 (CYP) ja UDP-glukuronosyylitransferaasi (UGT). Tässä väitöskirjatyössä kehitettiin moderneja mikrovalmistusmenetelmiä hyödyntäen entsyymimikroreaktoreita lääkeainemetabolian tutkimiseen virtausolosuhteissa. Mikrofluidistiikkan hyödyntäminen mahdollisti kokeellisten parametrien, kuten lääkeainepitoisuuden, yksinkertaisen säädön kokeen aikana. Mikrovalmistettujen reaktorien liittäminen yhteen muiden toiminnallisten yksiköiden kanssa on myös helppoa, mikä puolestaan vähentää sekä reagenssien kulutusta että systeemin aikaviivettä eli ns. kuollutta tilavuutta. Ensimmäisessä osajulkaisussa kehitettiin uudenlainen menetelmä solukalvoon sitoutuneiden, lääkeaineita metaboloivien entsyymien (CYP ja UGT) immobilisointiin. Tämä menetelmä perustui ihmisen maksamikrosomien biotinylointiin biotiinilla leimattujen, solukalvojen kanssa spontaanisti fuusioituvien liposomien avulla. Biotinyloidut maksamikrosomit immobilisoitiin tioleenipolymeereistä valmistettuihin, avidiinilla pinnoitettuihin mikroreaktoreihin. Tulosten perusteella maksamikrosomien immobilisointi ei vaikuttanut malliaineiden CYP-entsyymiaffiniteettiin. Toisessa osajulkaisussa selvitettiin kehitetyn mikroreaktorikonseptin soveltuvuutta UGT-entsyymien kinetiikan tutkimiseen virtausolosuhteissa. Tyypillinen ongelma UGT-välitteisen metabolian tutkimuksessa on nykyisten in vitro -menetelmien huono in vivo -korrelaatio. Työssä pyrittiin tutkimaan ilmiön mekanistista taustaa virtausolosuhteita hyödyntämällä. Erityisesti tutkittiin solukalvon yli tapahtuvan aineensiirron ja rasvahappovälitteisen inhibition vaikutusta UGT-metaboliaan in vitro. UGT-metabolian malliaineena käytetyn tsidovudiinin kinetiikka virtausolosuhteissa vastasi hyvin staattisilla menetelmillä saatuja tuloksia, ilman tarvetta solukalvoa rikkoville lisäaineille, kuten alametisiinille. Kolmannessa osajulkaisussa mikroreaktorikonseptia täydennettiin hapen osapaineen säädöllä. Tämä toteutettiin hyödyntämällä tioleenipolymeerin ainutlaatuista kykyä reagoida molekulaarisen hapen kanssa. Työssä osoitettiin, että tioleenien aikaansaaman happidepleetion avulla on mahdollista säätää hapen tasoa mikroreaktorin sisällä nopeammin ja yksinkertaisemmin kuin perinteisillä menetelmillä. Työssä kehitetyt menetelmät säilyttivät tutkittujen CYP- ja UGT-entsyymien aktiivisuuden ja entsyymikineettiset ominaisuudet, mikä on ensisijaisen tärkeää käytännön sovellusten kannalta. Solukalvon biotinylointiin perustuva immobilisointimenetelmä ei kärsi tavanomaisten menetelmien tapaan diffuusiorajoitteisesta kinetiikasta tai entsyymi-inaktivaatiosta. Lisäksi menetelmä soveltuu minkä tahansa solukalvoproteiinin immobilisointiin. Tioleenipolymeerien kyky reagoida hapen kanssa, yhdistettynä mikrofluidistiikan hyödyntämiseen mahdollistivat happipitoisuuden nopean säädön mikroreaktorin sisällä. Verrattuna aikaisempiin teknisiin ratkaisuihin, työssä kehitetty menetelmä hapen säätöön ei vaadi monimutkaisia rakenteita tai paineistettuja kaasuja. Työssä tsidovudiinilla osoitetun happiherkän lääkeainemetabolian tutkimisen lisäksi kehitetyllä alustalla on runsaasti sovelluksia esimerkiksi mikrofluidistiikkaa hyödyntävissä solukasvatuksissa (engl. organ-on-a-chip). Yhteenvetona voidaan todeta, että kehitetty mikroreaktorikonsepti tarjoaa monipuolisen työkalun lääkeainemetabolian tutkimiseen virtausolosuhteissa, ja ratkaisee useita sekä nykyisiin staattisiin in vitro -malleihin että jo käytössä oleviin mikroreaktorimalleihin liittyviä haasteita ja ongelmia. Kehitetty immobilisointimenetelmä ei tavanomaisten menetelmien tapaan vaikuta kalvoon sitoutuneiden entsyymien stabiiliuteen tai entsyymiaffiniteettiin, ja soveltuu siten erityisesti CYP- ja UGT-välitteisen metabolian tutkimukseen. Läpivirtausreaktoreihin perustuva lääkeainemetaboliatutkimus taas mahdollistaa uudentyyppisiä koeasetelmia, joilla on sovelluksia erityisesti esimerkiksi lääke-entsyymi- ja lääke-lääke-yhteisvaikutusten mekanismien tutkimisessa.
Subject: farmaseuttinen kemia
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
kiiski_iiro_dissertation_2021.pdf 5.156Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record