Improving safety and efficiency of CRISPR-Cas9-mediated gene editing

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202102111471
Title: Improving safety and efficiency of CRISPR-Cas9-mediated gene editing
Author: Soppa, Inkeri
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Faculty of Biological and Environmental Sciences
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2020
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202102111471
http://hdl.handle.net/10138/326359
Thesis level: master's thesis
Discipline: perinnöllisyystiede
Genetics
genetik
Abstract: CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR associated protein) on kasvattanut suosiotaan geenien muokkaustyökaluna, koska Cas9-proteiineilla aikaansaatavat geneettiset muokkaukset eri puolilla genomia ovat helppo toteuttaa vaihtamalla ohjaavaa RNA:ta (guide RNA, gRNA). Tämän tutkielman tarkoituksena on CRISPR-Cas9:n turvallisuuden ja tehokkuuden kohentaminen muokkaamalla menetelmän Cas9-proteiinia. Tavoitteena on kehittää CRISPR-Cas9-menetelmä, jonka avulla kaikki potilassolujen mutaatiot olisivat korjattavissa. Yleisesti CRISPR-Cas9-menetelmää voi erityisesti soveltaa monogeenisistä sairauksista kärsivien potilaiden soluihin esimerkiksi muokkaamalla immuunipuutossairauksista kärsivien potilaiden pitkäikäisiä hematopoieettisia kantasoluja. CRISPR-Cas9 löytää kohteensa ja saa aikaan kaksijuosteisen DNA:n katkoksen. Tämän jälkeen Cas9-nukleaasin aiheuttamat kaksijuosteisen DNA:n katkokset voidaan korjata solun DNA:n korjaukseen erikoistuneiden menetelmien avulla joko kaksijuosteisen DNA:n päiden yhteenliittämisellä (non-homologous end-joining, NHEJ) tai homologiaan perustuvalla korjausmekanismilla (homogy-directed recombination, HDR). Monissa kliinisissä sovelluksissa HDR on toivottu korjausmekanismi, koska se korjaa kaksijuosteisen DNA:n katkoksen tarkasti eksogeenisen korjausoligon mukaan. Vaikka CRISPR-Cas9 on tehokas menetelmä, sen kehittäminen on välttämätöntä ennen potilassovelluksia; CRISPR-Cas9 aiheuttaa p53-välitteisen vauriovasteen, joka puolestaan aiheuttaa solusyklin pysähtymisen G1-vaiheeseen estäen tarkan, HDR-editoinnin. Muita CRISPR-Cas9:n aiheuttamia ongelmia ovat DNA:n korjausmenetelmän valinnan riippuminen solusyklin vaiheesta, eksogeenisen DNA:n korjausmallin läheisyys sekä satunnaiset ja kohdentamattomat mutaatiot. Tutkielmassa tutkitaan Cas9-proteiinifuusioita DNA:n korjauksessa auttavien proteiinien kanssa, ja niiden vaikutusta editoinnintehokkuuteen HEK293T, BJ5-ta ja RPE solulinjoissa. Lisäksi tutkielmassa validoidaan CRISPR-Cas9:n kiinnittyvä solusykliajastin, kuten AcrⅡA2-cdt1 -proteiini. Solusykliajastimet edistävät editointia solusylin S/G2-vaiheissa, jolloin p53-välitteistä vauriovastetta ei synny. AcrⅡA2-cdt1 on reversiibeli, faagista löydetty CRISPR inhibiittoriproteiini fuusioituna solusykli-indikaattoriin, joka valikoiden estää CRISPR-Cas9-mentelmän toiminnan solusyklin G1-vaiheessa. Sen sijaan AcrⅡA2-cdt1 irtautuu CRISPR-Cas9:stä solusyklin S-vaiheessa. Tutkielmassa tuodaan laajasti esiin CRISPR-Cas9 editointi ja siihen liittyvät haasteet kuolemattomissa solulinjoissa ja primaareissa soluissa. Tutkielman rakenne koostuu solulinjojen muokkaamisesta sekä sitä seuraavasta Cas9-proteiinifuusioiden todentamisesta. Tutkielmassa myös käsitellään primaaristen T-solujen ja CD34+ hematopoieettisten kantasolujen eletroporaation optimointia, mikä puolestaan tuo tutkielman lähemmäs potilassovelluksia. Tutkielmassa osoitetaan, että Cas9-proteiinifuusion editointitehokkuuteen vaikuttaa CRISPR-Cas9:n kohdesekvenssi sekä solutyyppi. Lisäksi fuusioiden ja solusykliajastimen validioinnin yhteydessä selvisi, että solulinjojen ja interleukiineilla stimuloitujen CD4+ T-solujen editointitehokkuus riippuu solujen jakautumisnopeudesta. Primaaristen T-solujen ja CD34+ hematopoieettisten kantasolujen eletroporaatio on optimoitu tehokkaaksi mukauttamalla muun muassa proteiinikompleksin määrä, soluviljelyaika ja elektroporaatio-ohjelma. CRISPR-Cas9:n turvallisuuden ja tehokkuuden kohentaminen muokkaamalla menetelmän Cas9-proteiinia on mahdollista riippuen solutyypistä sekä sen jakautumisnopeudesta. Editointitehokkuuden lisääntyy ajastamalla CRISPR-Cas9:n toimintaa. Tutkielmassa esitetyt menetelmät mahdollistavat translaationaaliset sovellukset.The Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) and CRISPR associated protein (Cas9) (CRISPR-Cas9) system is a widely used gene editing technology due to its potential to alter the genome precisely in desired locations. Due to the potential of the CRISPR-Cas9 system, the objective of the thesis is to improve the precise editing of genes by modifying the CRISPR-Cas9 platform. Ultimately, the aim is to develop a platform that can edit any mutation and repair it to a normal, functional gene in patient cells. In general, CRISPR-Cas9 provides opportunities in treating monogenic diseases, for example by modifying long-term hematopoietic stem cells in immunodeficiencies. CRISPR-Cas9 can target disease-causing mutation sites and introduce double-strand breaks. Afterwards, the native DNA repair machinery of a cell repairs the cut site either by more efficient, error-prone non-homologous end joining (NHEJ) or precise homology-directed recombination (HDR). In most clinically oriented genome editing studies, the desired repair outcome is the latter because it allows precise repair of the mutation according to the exogenous repair template. Despite all its positive features, the optimization of CRISPR-based editing system is crucial before medical use; CRISPR-Cas9 induces a p53-mediated DNA damage response, which leads to a transient G1 cell cycle arrest and hampers HDR-based precision genome editing. Other problems include the repair pathway depending on the cell cycle phase, repair template proximity, and off-target activity. This thesis demonstrates that Cas9 fusions allow addressing the problems mentioned above. Cas9 fusions with DNA repair proteins ensure improved editing efficiency at the close proximity to the target site in HEK293T, BJ5-ta and RPE reporter cell lines. In addition, Cas9 coupled with the engineered cell cycle timer, AcrⅡA2-cdt1, favors the editing at the S/G2 cell cycle phases avoiding the p53-mediated response. AcrⅡA2-cdt1 is a reversible, phage-derived CRISPR inhibitor that selectively inhibit CRISPR-Cas9 at the G1 cell cycle phase and releasing it at the S phase. This thesis provides extensive look on the CRISPR-Cas9 editing and its challenges in immortalized cell lines and primary cells. In the thesis, the generation of reporter cell lines is prior to the validation of the novel Cas9-fusions. Furthermore, the optimization of primary T cell and CD34+ hematopoietic stem cell electroporation with different electroporation systems brings the study closer to clinical applications. The thesis provides insights about the effect of the target site and the cell type for genome editing outcomes. The editing efficiencies depend on the Cas9 fusion protein, cell type and its proliferation rate. The editing efficiency in primary T cells and CD34+ hematopoietic stem cells can significantly improve by optimizing transfection and culturing conditions, such as concentration of the CRISPR-Cas9 complex, cell culturing time and electroporation program. Cas9 fusions improve the safety and efficiency of the CRISPR-Cas9 system depending the cell type and the proliferation rate of the cell. Timing the induction of double-strand breaks also improves the editing efficiency. Overall, the methods used in the thesis give useful tools for eventual translational applications.
Subject: CRISPR-Cas9
Cas9-fusion
AcrⅡA2-cdt1
HDR and NHEJ editing efficiency
reporter cell lines


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record