Molecular and cellular markers of subclinical graft fibrosis after pediatric liver transplantation and noninvasive assessment of liver fibrosis

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-7196-2
Title: Molecular and cellular markers of subclinical graft fibrosis after pediatric liver transplantation and noninvasive assessment of liver fibrosis
Author: Voutilainen, Silja
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Medicine
Doctoral Program in Clinical Research
Children's Hospital in Helsinki University Hospital
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2021-04-16
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-7196-2
http://hdl.handle.net/10138/328309
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Subclinical fibrosis and inflammation are common findings in pediatric hepatic diseases and in liver grafts after liver transplantation (LT). The mechanisms of these histopathological changes are unclear. Biomarkers that would precede these changes and non-invasive ways to assess fibrosis are needed. The aim of this thesis was to investigate the molecular and cellular markers of subclinical graft fibrosis and non-invasive methods to determine the stage of fibrosis and varices. Study I included 99 pediatric patients with chronic liver disease who underwent liver biopsy sampling for histology and transient elastography (TE) study for liver stiffness (LS) between January 2012 to March 2015. In addition, data on spleen size, platelet count, and aspartate aminotransferase to platelet ratio index (APRI) were collected. Esophagogastroduodenoscopy (EGD) was performed for 61 patients to assess varices. LS had the best accuracy in the prediction of liver fibrosis stage, compared to APRI, spleen size, and platelets to spleen size score. For moderate fibrosis (≥F2) and cirrhosis (F4) the area under receiver curve (AUROC) values for LS were 0.831 (95%CI: 0.745-0.981, p<0.001) and 0.919 (95%CI: 0.861-0.977, p<0.001, respectively). APRI performed little better in the prediction of varices with AUROC 0.832 [95%CI: 0.730-0.934, p<0.001), compared to LS with AUROC 0.818 (95%CI: 0.706-0.930, p<0.001). Patients of studies II-IV consisted of pediatric LT patients who underwent LT in Finland between 1987-2007 and were available for the study in 2009-2011 (time point referred here as cross-section/first follow-up) (n=54). The median time from LT was 11 years. All patients underwent liver biopsy sampling for histological evaluation and blood sampling for liver biochemistry. In Study II, serum concentrations of matrix metalloproteinase-8 (MMP-8), MMP-9, and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 (TIMP-1) were analyzed from 52 patients and 94 healthy controls. Also, hepatic gene expression of MMPs and TIMPS genes was measured from 29 patients and eight control liver samples. The findings were correlated with histological findings. Patients with graft fibrosis had significantly increased hepatic gene expression of MMP-2, MMP-9, MMP-14, TIMP-1, and TIMP-2, compared to those without fibrosis (Mann-Whitney U test p-values ranging from 0.001 to 0.031). However, serum concentrations of MMP-8, MMP-9 TIMP-1 were unrelated to the presence of graft fibrosis. In Study III, hepatic gene expression of 40 fibrosis-related genes was measured from 29 patients and eight healthy controls. Gene expression levels were correlated with histological findings. Compared to patients with normal histology, patients with fibrosis and no inflammation had higher hepatic gene expression of genes related to fibrosis: transforming growth factor-3 (TGF-3), connective tissue growth factor (CTGF), platelet-derived growth factor subunit- (PDGF-), PDGF-, integrin-subunit-1, -smooth muscle cell actin (-SMA), and type I collagen and lower gene expression of decorin and vascular endothelial growth factor A (VEGF A) (Mann-Whitney U test p-values ranging from 0.005 to 0.049). However, compared to patients with normal histology, patients with fibrosis and inflammation had much fewer differences in the gene expression of the fibrosis-related factors than patients with solely fibrosis. Study IV included 51 patients who had sufficient liver biopsy for immunohistochemical staining of six biomarkers; -SMA, type I collagen, decorin, vimentin, p-selectin glycoprotein-1 (PSGL-1), and CD34. Immunohistochemical staining was also performed on 29 patients' biopsy samples taken at the LT operation available from the biobank. Before November 2019, at the final assessment, data on patient (n=48, three deceased) liver status was evaluated. Second liver biopsies (taken after the first follow-up) were available from 24 patients for histological evaluation. The immunohistochemically assessed expression of the six biomarkers at the time of the operation was unrelated to the presence of graft fibrosis at the first follow-up. The expression -SMA, type I collagen, decorin and vimentin correlated with simultaneous graft fibrosis (r=0.693, p<0.001; r=0.612, p<0.001; r=0.464, p=0.003; and r=0.562, p<0.001, respectively). Increased portal expression of -SMA, decorin, and vimentin in liver grafts without fibrosis at the first follow-up were observed in patients who later developed fibrosis (second follow-up biopsies) (Fisher's exact test p-values: 0.014, 0.024, and 0.024 respectively). Moderate fibrosis (≥F2) and increased expression of -SMA, type I collagen, decorin, and vimentin at the first follow-up associated with suboptimal liver status at the final assessment (Fishers exact test p=0.002, p=0.003, p=0.003, p=0.003, p=0.042, p=0.014 and p=0.004 respectively). Our findings implicate that the hepatic gene expression of MMPs and TIMPs is altered in patients with fibrosis after LT. Still, the serum concentration of MMPs and TIMPs was unrelated to graft fibrosis or their gene expression. The genes related to fibrosis were mostly associated with graft fibrosis without inflammation after LT. The immunohistochemically assessed expression of -SMA, decorin, and vimentin might precede the development of later fibrosis and suboptimal liver status, but their expression at the time of LT seems to be unrelated to later graft fibrosis. LS and APRI could be used in some cases to rule out moderate fibrosis and varices and thus avoid invasive liver biopsy sampling and EGS.Maksansiirto on tehokas hoitomuoto parantumatonta maksasairautta potevilla lapsilla. Maksansiirtojen pitkäaikaisennuste on hyvä. Viime vuosina on kuitenkin raportoitu siirteen lievää tulehdusta ja sidekudoslisää potilailla, joiden vointi ja siirteen toiminta ovat moitteettomat. Näiden muutosten syy ja merkitys on avoin. Maksasta otetun koepalan histologinen analyysi on standardi tutkimus maksan tilan tutkimiseksi. Kajoavana tutkimuksena siihen liittyy kuitenkin haittoja. Tässä väitöskirjassa tutkittiin maksansiirron lapsuudessaan saaneiden potilaiden sidekudoslisän ja tulehduksen syitä molekyyli- ja solutasolla, sekä ei-kajoavia keinoja sidekudoslisän toteamiseksi. Tutkimuksessa I selvitettiin maksan sidekudoslisän asteen ja ruokatorven/mahalaukun laskimolaajentumien toteamista neljällä ei-kajoavalla menetelmällä: 1. transientti elastografia (TE), 2. aspartaattiaminotransferaasi-verihiutaleindeksi (APRI), 3. verihiutalemäärä ja 4. verihiutale pernan koko indeksi. Tutkimuskohteena oli 99 kroonista maksasairautta potevaa lapsipotilasta, jotka osallistuivat tutkimukseen vuosina 2012-2015. Kaikille suoritettiin maksan kudospalan histologinen tutkimus ja tehtiin TE-mittaukset. 61 potilaalle tehtiin myös ruokatorvimahalaukun tähystys laskimolaajentumien toteamiseksi. TE osoittautui parhaaksi ja kohtalaisen tarkaksi sidekudoslisän asteen määrittämisessä, kun taas APRI toimi hieman paremmin laskimolaajentumien toteamisessa. Tutkimuksissa II-IV kohteena olivat vuosina 1987–2007 lapsuudessaan maksansiirron saaneet potilaat. Tutkimuksen aikaan vuosina 2009–2011 siirrosta oli keskimäärin 11 vuotta (n=54). Tuolloin kaikista potilaista otettiin maksan kudosnäytteet ja laboratoriokokeet. Tutkimuksissa III ja IV maksasiirteen ja potilaan kliinistä tilannetta tarkasteltiin myös 19 vuoden kohdalla, marraskuussa 2019. Tutkimuksessa II selvitettiin potilaiden matrix metalloproteinase (MMP) ja tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP) molekyylien seerumipitoisuuksia ja geenien ilmentymistä maksasiirteissä. MMP-2, MMP-9 MMP-14, TIMP-1 ja TIMP-2 -molekyylien lähetti-RNA-pitoisuudet siirteessä korreloivat positiivisesti sidekudoksen määrään ja TIMP-1:n osalta myös maksan tulehdukseen. MMP-8:n, MMP-9:n ja TIMP-1:n seerumipitoisuudet eivät olleet yhteydessä histologisiin muutoksiin. Tutkimuksessa III tarkasteltiin 40:n sidekudoslisän kehitykseen liittyvän geenin ilmentymistä maksasiirteissä. Potilaat jaettiin kolmeen ryhmään histologisten löydösten perusteella. Suurimmat lähetti-RNA:n pitoisuudet todettiin potilailla, joilla oli sidekudoslisää ilman tulehdusta verrattuna kontrolleihin ja potilaisiin, joilla ei ollut sidekudoslisää tai tulehdusta. Paljon vähemmän löydöksiä sidekudoslisän kehitykseen liittyvien geenien ilmentymisessä todettiin potilailla, joilla oli sekä sidekudoslisää ja tulehdusta. Tutkittujen geenien ilmentymisellä 11 vuoden kohdalla ei ollut yhteyttä maksasiirteen tilaan 19 vuoden kohdalla. Tutkimuksessa IV analysoitiin kuuden eri merkkiproteiinin [-smooth muscle cell (-SMA), type I collagen, decorin, vimentin, p-selectin glycoprotein-1 (PSGL-1), and CD34] immunohistokemiallista ilmentymistä maksasiirteissä leikkaushetkellä ja seurannassa noin 11 vuotta myöhemmin. Merkkiproteiinien ilmentyminen siirtohetkellä ei ollut yhteydessä 11 vuotta myöhemmin todettuun sidekudoslisään. 11 vuoden kohdalla todettu maksan sidekudoslisä korreloi positiivisesti -SMA:n, tyyppi I kollageenin, decorinin ja vimentinin ilmentymiseen. 11 vuoden kohdalla suurentunutta -SMA:n, tyypi I kollageenin ja decorinin ilmentymistä todettiin myös potilailla joilla silloin ollut sidekudoslisää, mutta jotka myöhemmin kehittivät sitä. Merkittävä sidekudoslisä, suurentunut -SMA, tyypi I kollageeni,, decorin ja vimentin ilmentyminen 11 vuoden kohdalla oli verrrannolinen huonompaan siirteen tilaan 19 vuoden kohdalla. Yhteenvetona voidaan todeta, että TE:tä ja APRI:a voidaan käyttää lasten maksasairauksien seurannassa sidekudoslisän asteen arvioinnin tukena. Seurantakoepalan ottoja voidaan mahdollisesti välttää potilailla, joilla on matalat TE ja APRI arvot. Maksansiirtopotilailla poikkeavaa MMP- ja TIMP- geenien ilmentymistä todettiin seurannassa niillä, joilla siirteessä oli sidekudoslisää. MMP-8:n , MMP-9:n ja TIMP-1:n seerumipitoisuudet eivät olleet verrannollisia sidekudoksen määrään, eivätkä siksi tämän tutkimuksen valossa sovellu sidekudoslisän asteen määrittämiseen maksansiirto potilailla. Maksansiirron jälkeen, sidekudoslisän geenien muuttuneen ilmentymisen todettiin liittyvän erityisesti tilanteeseen, jossa havaittiin siirteen sidekudoslisää ilman tulehdusta. Maksansiirron jälkeen -SMA-, decorin- ja vimentin-merkkiproteiinien lisääntyminen siirteessä saattaa edeltää sidekudoslisän muodostumista ja olla verrannollinen siirteen huonompaan tilaan jatkossa, näiden proteiininen ilmentyminen siirron hetkellä ei ole yhteydessä myöhempään siirteen sidekudoslisän kehitykseen.
Subject: lääketiede
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
voutilainen_silja_dissertation_2021.pdf 3.408Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record