Optimized sample preparation protocol for the metatranscriptomic analysis of bloodstream infections

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202104071858
Title: Optimized sample preparation protocol for the metatranscriptomic analysis of bloodstream infections
Author: Tommila, Jenni
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2021
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202104071858
http://hdl.handle.net/10138/328807
Thesis level: master's thesis
Abstract: Bakteerien pääsy vereen eli bakteremia voi aiheuttaa vakavia ja kalliita terveysongelmia. Se voi johtaa sepsikseen, joka on yksi maailman yleisimmistä kuolleisuuden syistä. Avainasemassa sepsiksen onnistuneessa hoidossa ovat varhainen ja tarkka diagnoosi sekä nopea hoidon aloitus. Nykyinen diagnosointi perustuu kuitenkin aikaa vieviin veriviljelyihin sekä kliinisiin oireisiin, jotka eivät ole spesifisiä taudinaiheuttajalle. Nykyiset kustannustehokkaat suurtehosekvensointimenetelmät (engl. Next generation sequencing; NGS) mahdollistavat uuden viljelyvapaan tavan tutkia veren bakteereita. Metagenomiikkaa, jossa tutkitaan näytteen koko eliöyhteisön DNA:ta sekvensoimalla, käytetään tutkimuksessa usein. Se kuvaa kuitenkin vain yhteisön geneettistä potentiaalia eikä myöskään erottele eläviä mikrobeja kuolleista. Metatranskriptomiikalla, jossa sekvensoidaan kaikki RNA näytteestä, saadaan puolestaan tietoa mikrobien toiminnallisesta aktiivisuudesta sekä tunnistetaan vain eläviä mikrobeja. Runsas isäntäsolujen ja -RNA:n määrä kuitenkin hankaloittaa bakteerien ilmentämien perintötekijöiden, transkriptien analysointia. Tässä tutkielmassa tarkastelin ratkaisuja tehokkaaseen bakteeri-RNA:n eristämiseen ja rikastukseen verestä. Tavoitteena oli optimoida näytteen valmisteluprotokolla sekvensointia ja metatranskriptomista analyysiä varten. Ensimmäiseksi testasin kahden kaupallisen verinäyteputken kykyä hajottaa bakteerisoluja. Testaus tehtiin Escherichia coli - ja Staphylococcus epidermidis - bakteereilla. Molemmat putket, Tempus ja RNAgard, kykenivät hajottamaan gram-negatiivisia E. coli -soluja ja hyvälaatuista RNA:ta saatiin eristettyä mitattavissa olevina määrinä valmistajien suosittelemilla RNA -eristysmenetelmillä. Tempus-putkilla RNA-saannot olivat selkeästi korkeammat. Gram-positiivisella S. epidermidis -bakteerilla RNA:n määrät jäivät mittausrajojen alapuolelle, mikä viittaa tehottomaan solujen hajoamiseen ja lisäoptimoinnin tarpeeseen. Toiseksi optimoin isäntämateriaalin poistamista bakteerimateriaalin rikastamiseksi. Ryhmässä oli aiemmin kehitetty protokolla polyadenyloitujen (poly-A) transkriptien poistamiseen ja sen tehokkuutta tarkasteltiin osana tätä tutkielmaa. Protokollan muunnoksia testattiin, jotta nähtäisiin, voiko poly-A -transkriptien poiston tehokkuutta parantaa. Merkittävin muutos oli oligo-dT -helmien määrän vähentäminen puoleen alkuperäisestä protokollasta. Kehitetyt protokollat olivat myös selkeästi tehokkaampia kuin kaupallinen ratkaisu, johon niitä verrattiin. Testauksissa käytettiin RT-qPCR ja dot blot -määrityksiä, jotka suunnittelin tutkielman ohella. Lopuksi testasin kaupallisen menetelmän globiinitranskriptien poistamiseksi ja yhdistin tämän poly-A -depleetioprotokollan kanssa. Jotta poly-A -transkriptien poisto verinäytteistä eristetystä RNA:sta olisi tehokasta, täytyy globiinitranskriptit ensin poistaa, sillä ne muodostavat jopa 80% eristetyistä poly-A -transkripteista. Optimoitu näytteen valmisteluprotokolla tarjoaa lähtökohdan uudenlaisille verenkierron infektio- ja sepsistutkimuksille. Prosessin seuraavat vaiheet, kuten sekvensointi ja testaus kliinisillä näytteillä, ovat jo käynnissä ja alustavat tulokset ovat lupaavia. Tulevaisuudessa metatranskriptomiikan lähestymistapaa voidaan käyttää patogeenien ja niiden antibioottiherkkyyksien nopeaan ja spesifiseen tunnistamiseen. Lisäksi saadaan tietoa infektiomekanismeista sekä isäntä-patogeeni -vuorovaikutuksista, mitä voidaan hyödyntää sepsiksen diagnosoinnissa sekä hoidossa.Bacteraemia, the presence of bacteria in the bloodstream, may lead to severe and costly health issues. Sepsis, a serious complication of bacteraemia, is one of the top causes of mortality globally. Early and specific diagnostics as well as fast acting are essential in successful treatment. However, current diagnosis relies mainly on time-consuming blood culturing and clinical symptoms, which are unspecific for the causative agent. With the advanced technology and decreasing cost, state-of-art sequencing-based (Next generation sequencing) methods provide a new way to investigate the bacteria present. Metagenomics, which means sequencing and studying all DNA extracted from a microbial community sample, is widely used, but it only describes the genetic potential of a community and does not differentiate live from dead microbes. Metatranscriptomics, in which essentially all RNA from a sample is sequenced, provides information about expression and activity together with identification of viable bacteria, However, the high amounts of host cells and host RNA complicate the detection of bacterial transcripts from complex host-microbe samples. In this thesis, I investigated solutions for the efficient isolation and enrichment of bacterial RNA from whole blood to be used in sequencing and metatranscriptomics analysis. Firstly, I tested the capability of bacterial cell lysis of two commercial blood sampling tubes with Escherichia coli and Staphylococcus epidermidis suspensions. Both tubes, Tempus and RNAgard, were able to lyse gram-negative E. coli cells and good-quality RNA was extracted in measurable quantities with their respective RNA extraction methods. With Tempus tubes the RNA yield was clearly higher. With gram-positive S. epidermidis, RNA quantities from both extractions were below the measurement limits indicating insufficient lysis and need for further optimization. Secondly, I investigated the depletion of polyadenylated (poly-A) transcripts in order to reduce the host transcripts and thus to enrich the bacterial transcripts prior to costly sequencing step. I evaluated the performance of a previously designed in-house protocol, based on the capture of poly-A -transcripts with oligo-dT -beads, and tested different parameters to see whether the depletion efficiency could be enhanced. Most significantly, the amount of oligo-dT -bead suspension was reduced to half from the original protocol. In-house protocols were also compared to a commercial solution, which they clearly outperformed. Depletion performances were tested with a RT-qPCR and dot blot assay, which I designed along this thesis work. Finally, to make the poly-A depletion better suited for blood samples infested with globin transcripts (representing up to 80% of all poly-A transcripts extracted from whole blood), I tested and successfully pipelined the leading commercial method for depleting globin transcripts with the in-house poly-A depletion protocol. The optimized sample preparation protocol provides a platform for further bloodstream infection and sepsis studies. Next steps of the process, such as sequencing and testing with clinical samples, are already ongoing with promising preliminary results. In the future, the metatranscriptomics approach can be utilized in fast and specific identification of the pathogens and their antibiotic susceptibilities. In addition, infection mechanisms and host-pathogen interactions may be studied possibly providing novel insights for sepsis diagnostics and treatment.
Subject: bacteraemia
bloodstream infection
sepsis
RNA extraction
enrichment
metatranscriptomics


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record