TrkB and ERK signaling in the mechanism of NMDA receptor-blocking antidepressants

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202105102092
Title: TrkB and ERK signaling in the mechanism of NMDA receptor-blocking antidepressants
Alternative title: TrkB- ja ERK-signalointi NMDA-reseptoria salpaavien masennuslääkkeiden mekanismissa
Author: Annala, Iina
Other contributor: Helsingin yliopisto, Farmasian tiedekunta
University of Helsinki, Faculty of Pharmacy
Helsingfors universitet, Farmaceutiska fakulteten
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2021
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202105102092
http://hdl.handle.net/10138/329725
Thesis level: master's thesis
Degree program: Proviisorin koulutusohjelma
Master's Programme in Pharmacy
Utbildningsprogrammet för provisorexamen
Specialisation: Farmakologia
Pharmacology
Farmakologi
Abstract: Subanesteettinen annos ketamiinia, N-metyyli-D-aspartaatti (NMDA)-reseptorin salpaajaa, lievittää masennuksen oireita nopeasti, ja vaikutus kestää kauan sen elimistöstä poistumisen jälkeen. Vaikka tarkka mekanismi ei ole vielä selvillä, on TrkB (tropomyosiinireseptorikinaasi B), ERK (solunulkoisen signaalin säätelemä kinaasi 1 ja 2), GSK3β (glykogeenisyntaasikinaasi 3β) ja mTOR (engl. mammalian target of rapamycin)-signaloinnin säätely etuaivokuorella yhdistetty ketamiinin masennuslääkkeenkaltaisiin vaikutuksiin jyrsijöillä. Lisäksi α-amino-3-hydroksi-5-metyyli-4-isoksatsolipropionihappo (AMPA)-reseptorien aktivaation ajatellaan olevan tärkeä osa sen mekanismia. Typpioksiduuli (N2O), joka niin ikään on NMDA-reseptorin antagonisti ja otaksuttu nopeavaikutteinen masennuslääke, säätelee samoja molekulaarisia signalointireittejä jyrsijöiden etuaivokuorella kuin ketamiini. Typpioksiduulin nopeaa farmakokinetiikkaa hyödyntämällä on huomattu, että sen akuuttien farmakologisten vaikutusten (NMDA-reseptorin salpauksen) aikana havaitaan lisääntynyt ERK:n fosforylaatio ja muita hermosolujen eksitaatioon liitettyjä signalointimuutoksia, kun taas TrkB:n, GSK3β:n ja P70S6K:n fosforylaation säätely ilmenee vasta typpioksiduulin eliminaation jälkeen. Tämän tutkimuksen ensimmäisessä osassa tutkimme typpioksiduulin aiheuttamia hermosolujen eksitaatioon ja BDNF-TrkB signalointiin liittyviä biokemiallisia muutoksia etuaivokuorella, ja lisäksi, AMPA-reseptorien aktivaation roolia näiden aikaansaamisessa. Keskityimme muutoksiin, jotka nähdään typpioksiduulin akuuttien farmakologisten vaikutusten jälkeen. Aikuisille C57BL/6-linjan uroshiirille annosteltiin 65% typpioksiduulia 20 minuutin ajan sen jälkeen, kun ne olivat saaneet injektiona joko AMPA-reseptorin salpaajaa (NBQX, 10 mg/kg) tai kontrolliliuosta (fysiologista suolaliuosta). Etuaivokuoren näytteet kerättiin 15 minuuttia typpioksiduulin annon lopettamisen jälkeen, jolloin sen oletetaan eliminoituneen elimistöstä kokonaan. Näytteet analysoitiin käyttäen western blot, ELISA (engl. enzyme-linked immunosorbent assay) ja RT-qPCR (kvantitatiivinen käänteistranskriptaasi PCR) menetelmiä. Havaitsimme, että typpioksiduuli lisäsi TrkB:n, GSK3β:n ja P70S6K:n fosforylaatiotasoja riippumatta siitä, olivatko eläimet saaneet ennen typpioksiduulia NBQX- vai suolaliuos-injektion. Samanaikaisesti ERK:n fosforylaatiossa nähtiin typpioksiduulin annon jälkeen väheneminen, joka oli heikentynyt eläimillä, jotka saivat NBQX:ää ennen typpioksiduulia. BDNF-proteiinin tai sen lähetti-RNA:n (eksoni IV) kudostasoissa ei havaittu muutoksia ryhmien välillä. Tulokset viittaavat siihen, että typpioksiduulin aikaansaama TrkB:n ja ERK:n säätely on toisistaan riippumatonta. AMPA-reseptorin aktivaatio ei näytä vaikuttavan TrkB-signalointiin, vaikka se saattaa säädellä ERK-signalointia. Lisäksi TrkB:n lisääntynyt fosforylaatio typpioksiduulin annon jälkeen tapahtuu ilman, että BDNF:n kudostasot nousevat. Tutkimuksen toisessa osassa tavoitteena oli etsiä ketamiininkaltaisia NMDA-reseptorin salpaajia, joilla on potentiaalisia masennuslääkevaikutuksia. Löytääksemme kaupallisia ketamiinianalogeja, suoritimme tietokoneavusteisesti osarakennehaun ketamiinin rakenteeseen perustuen. Löydetyt ketamiinianalogit suodatettiin niiden laskennallisten ADMET-ominaisuuksien perusteella, jonka jälkeen suoritettiin virtuaalinen seulonta telakoimalla yhdisteet NMDA-reseptorikompleksiin (protein data bank-koodi: 4TLM) ionikanavan alueelle, ketamiinin ennustetun sitoutumispaikan läheisyyteen. Lopuksi pyrimme selvittämään, saavatko valitut ketamiinianalogit aikaan ketamiininkaltaisia vaikutuksia TrkB- ja ERK- signalointiin primaarisessa hermosoluviljelmässä. Emme kuitenkaan edenneet testaamaan ketamiinianalogeja, sillä ketamiini (positiivinen kontrolli) ei vaikuttanut TrkB:n tai ERK:n fosforylaatioon meidän viljelmässämme. Kaiken kaikkiaan tämä tutkimus edistää ymmärrystä typpioksiduulin mekanismista, joka mahdollisesti valottaa myös yleisemmin NMDA-reseptoria salpaavien masennuslääkkeiden mekanismia. Lisäksi löysimme lupaavia ketamiinianalogeja, jotka odottavat kokeellista testausta.Subanesthetic-dose ketamine, an N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR) blocker, exerts rapid antidepressant effects that sustain long after its elimination from the body. The precise mechanism remains unknown, but regulation of TrkB (tropomyosin receptor kinase B), ERK (extracellular-regulated kinase 1 and 2), GSK3β (glycogen synthase kinase 3β) and mTOR (mammalian target of rapamycin) signaling within the prefrontal cortex (PFC) have been deemed important for its antidepressant-like effects in rodents. In addition, activation of α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors (AMPARs) is thought to be an important step in its mechanism. Nitrous oxide (N2O), another NMDAR antagonist and a putative rapid-acting antidepressant, regulates the same molecular pathways as ketamine in the rodent PFC. The fast pharmacokinetics of N2O have been exploited to show that markers of neuronal excitation, including phosphorylation of ERK, are upregulated in the PFC during its acute pharmacological effects (NMDAR blockade), while regulation of TrkB, GSK3β and P70S6K emerges only upon N2O withdrawal. In the first part of this study, we investigated the N2O-induced biochemical changes associated with neuronal excitation and BDNF-TrkB signaling in the PFC and further, the requirement for AMPAR activation in inducing them. We focused on the effects seen after the acute pharmacological effects of N2O. N2O (65% for 20 min) was administered to adult male C57BL/6 mice with or without pretreatment with AMPAR antagonist (NBQX, 10 mg/kg) and PFC samples were collected 15 minutes after stopping N2O delivery. Within this time N2O is expected to be completely eliminated. The brain samples were analyzed using western blot, enzyme-linked immunosorbent assay and quantitative reverse transcription PCR. We observed that N2O increased levels of phosphorylated TrkB, GSK3β and P70S6K, and these effects were not attenuated by NBQX pretreatment. At the same time, we observed a decrease in the levels of phosphorylated ERK, which was attenuated in mice that received NBQX prior to N2O. Tissue levels of BDNF protein or messenger RNA (exon IV) were not different between control and experimental groups. These results indicate that the mechanism of N2O is associated with TrkB and ERK signaling that are regulated independently of each other. It appears that AMPAR activation is not required for TrkB signaling, although it might play a role in ERK signaling. Further, N2O-induced TrkB phosphorylation in the PFC is not associated with changes in total levels of BDNF. In the second part of the study, we aimed to search for new ketamine-like NMDAR blockers with antidepressant potential. Ketamine was used as a query compound for in silico substructure search to find commercial ketamine analogs. The retrieved ketamine analogs were filtered by their computed ADMET properties and then further screened virtually by docking them to the pore region of NMDAR complex (protein data bank code: 4TLM), around the predicted binding site of ketamine. Finally, we sought to study if selected ketamine analogs could elicit ketamine-like effects on TrkB and ERK signaling in mouse primary cortical neurons. However, we did not proceed to test the analogs since ketamine (positive control) did not show any effects on TrkB or ERK phosphorylation in our culture. Overall, this study advances the understanding of the mechanism of N2O, possibly giving new insight of the antidepressant mechanisms of NMDAR-blocking agents more generally. Additionally, we found promising ketamine analogs that await experimental testing...
Subject: nitrous oxide
ketamine
NMDA receptor blocker
AMPA receptor
TrkB
ERK
rapid-acting antidepressants
Full text embargoed until: 2022-05-07


Files in this item

Files Size Format View

Embargo on files ends: 2022-05-07

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record