CRISPR-Cas9 based genetic engineering and mutation detection in genus Nicotiana

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202105122196
Title: CRISPR-Cas9 based genetic engineering and mutation detection in genus Nicotiana
Author: Huhdanmäki, Tuukka
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2021
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202105122196
http://hdl.handle.net/10138/329883
Thesis level: master's thesis
Degree program: Maataloustieteiden maisteriohjelma
Master's Programme in Agricultural Sciences
Magisterprogrammet i lantbruksvetenskaper
Specialisation: Kasvintuotantotieteet
Plant Production Sciences
Växtproduktionsvetenskaper
Abstract: CRISPR-Cas9-menetelmä on yksi uusista geeniteknologian läpimurroista, joka hyödyntää kohdennettua mutageneesiä. Menetelmä perustuu Cas-perheen proteiineihin ja opas-RNA:han, jotka yhdistettynä mahdollistavat kohdentamisen valittuun sekvenssiin ja sen muokkaamisen halutulla tavalla. Tämän maisterintutkielman tavoitteena oli verrata eri CRISPR-Cas9-menetelmään perustuvia geenimuokkaustekniikoita Nicotiana-suvun kasveissa sekä onnistuneen mutaation tunnistamiseen tarvittavia tekniikoita. PDS1 ja PDS2 ovat geenejä, jotka koodaavat fytoeeni desaturaasi-entsyymin toimintaa kasveissa. Nämä geenit valittiin kohdegeeneiksi, koska mutatoitunut geeni saa aikaan valoherkän fenotyypin, joka on helppo tunnistaa viherhiukkasten vaurioitumisesta johtuvasta valkolaikukkaasta ilmiasusta. CRISPR-Cas9 ribonukleoproteiinikompleksivälitteinen transformaatio (RNP) käyttää hyväkseen erikseen tuotettua Cas9-proteiinia ja opas-RNA:ta, jotka yhdistettynä aikaansaavat ohimenevän geenimuutoksen solussa. Tätä tekniikkaa oli tarkoitus käyttää, mutta liukoisessa muodossa olevan Cas9-proteiinin tuottaminen koitui ongelmalliseksi eikä lopullista transformaatiota päästy tekemään. Tämän tutkimuksen valossa valmiin Cas9-proteiinin hankkiminen saattaa olla kannattavampaa kuin proteiinin tuottaminen alusta alkaen, kun tavoitteena on aikaansaada vain muutamia geenimuunneltuja kasveja. Agrotransformaatio on Nicotiana-suvulla hyväksi todettu agrobakteereita hyödyntävä geeninsiirtotekniikka ja kun tähän yhdistetään STU-CRISPR-Cas9-menetelmä, saatiin aikaan agrobakteerikantoja, jotka suorittavat geenimuokkauksen alusta loppuun yhden sekä Cas9-proteiinin että opas-RNA:n tuottavan plasmidin avulla. Onnistuneesti muokattuja kasveja saatiin aikaan sekä agroinfiltraatio että agrotransformaatio tekniikoilla. Menetelmän heikkoutena ovat mahdolliset off-target -mutaatiot, joita saattaa olla tarve ristisiittää pois populaatiosta. Tämä menetelmä ei sovellu kaikille eliöille ja on rajallisempi kuin RNP-välitteinen transformaatio, mutta on toiminnaltaan yksinkertainen ja soveltuva Nicotiana-sukuun. Onnistuneet mutaatiot tunnistettiin käyttämällä kaupallista T7E1 endonukleaasia sekä luonnollista CEL I endonukleaasia sisältävää selleriuutetta, jonka havaittiin soveltuvan edullisena vaihtoehtona tulosten varmistamiseen ja toistamiseen.CRISPR-Cas9 is one variant of newly emerging technologies utilizing targeted mutagenesis based on Cas family proteins and guide RNA that enable binding and modifying selected target sequence. The aim of the master’s thesis was to compare different methods of CRISPR-Cas9 induced gene editing in the genus Nicotiana and other secondary protocols necessary to identify successful mutations. PDS1 and PDS2 genes coding phytoene desaturase in plants were selected as target genes as mutant genotype produce visually identifiable photobleaching phenotype. CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complex mediated transformation uses separately produced Cas9 protein and guide RNA that when combined perform transient gene editing in cell. This method was planned to be used but Cas9 protein was challenging to produce in soluble form and final transformation was not achieved. This study suggests that acquiring ready-to-use Cas9 protein might be preferable choice when targeting only few transformations with CRISPR-Cas9 RNP-complex. Agrotransformation is well established method for genus Nicotiana and using Single Transcriptional Unit CRISPR-Cas9 system it is straightforward procedure from plasmid design to transformation. Successfully transformed plants were redeemed from transient agroinfiltration and stable agrotransformation experiments. Off-target mutations are possible and selective outbreeding may be needed. This method lacks the several advantages of CRISPR-Cas9 RNP-complex such as instant gene editing in cell, avoiding RNA interference and transformation over species boundaries, but is simple and functional in genus Nicotiana. Successful mutations were detected using commercial T7E1 and with natural CEL I endonuclease from celery extract. Celery extract can be used as cost-effective alternative to T7E1 for verifying or replicating previously confirmed results.
Subject: CRISPR-Cas9
Transformation
Nicotiana
Ribonucleoprotein
sgRNA
PDS1
PDS2


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Huhdanmaki_Tuukka_Pro_gradu_2021.pdf 3.699Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record