Multiplex RT-PCR in the diagnosis of human picornaviruses and human respiratory viruses

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-10-7964-1
Title: Multiplex RT-PCR in the diagnosis of human picornaviruses and human respiratory viruses
Author: Jokela, Pia
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Department of Biosciences
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2012-05-25
Language: en
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-10-7964-1
http://hdl.handle.net/10138/33306
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: The family Picornaviridae includes many human pathogens. Human enteroviruses (HEVs) exhibit a variety of clinical manifestations ranging from poliomyelitis and encephalomyelitis to respiratory infections and rashes. Human rhinoviruses (HRVs) are the major causes of the common cold. Human parechoviruses (HPeVs) and Aichi virus (AV) are mostly detected in cases of gastroenteritis, and hepatitis A virus (HAV) causes hepatitis with favourable prognosis. In addition to HEVs and HRVs, a large number of viruses are recognized as respiratory pathogens. The conventional respiratory pathogens include influenza A and B viruses, human respiratory syncytial virus (RSV), adenoviruses (AdVs), parainfluenza viruses (PIVs) and the human coronaviruses (hCoVs) OC43 and 229E. Moreover, several new respiratory pathogens, such as human metapneumovirus (hMPV), severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), and the hCoVs HKU1 and NL63 have been found during the 2000s. Human bocavirus (hBoV) is also increasingly being recognized as a true pathogen of humans. Since many clinical illnesses may be caused by several different viruses, multiplex assays for simultaneous detection of several viruses are increasingly being applied. Real-time multiplex polymerase chain reaction (PCR) assays for detection of viral nucleic acids offer remarkable benefits, such as short turnaround time and the non-necessity for handling amplified products. Since multiplexing, utilizing real-time PCR, is limited by reduction in amplification efficiency due to multiple primer and probe sets, separate amplification and hybridization reactions have re-emerged in attempts to develop tests with broad diagnostic range. With this approach microarrays, which have the potential for resolving complex mixtures of amplification products, may be applied. In this study, a multiplex reverse transcription-PCR (RT-PCR) and liquid hybridization assay for sensitive detection of HEV, HRV, HPeV and AV were developed and a single RT-PCR and liquid hybridization assay for detection of HAV was optimized. In analysis of clinical samples, the results obtained by the multiplex assay were consistent with those obtained by routine diagnostic assays. When 68 stool samples were analysed for the presence of HPeV and AV, one sample positive for HPeV was detected. This finding is in line with the current knowledge of neither of these viruses being very common enteric pathogens. More rapid detection of HEV and HRV in respiratory samples was achieved when a real-time duplex RT-PCR assay for detection of these viruses was developed. The same approach was used to develop another assay for more sensitive detection of RSV than with the direct fluorescent assay (DFA) and simultaneous identification of hMPV. Both multiplex real-time RT-PCR assays provided reliable and sensitive detection of their targets, except for detection of HRV, since doubts were raised on the ability of the assay to detect all rhinoviruses. Moreover, two commercial hMPV antibodies were found applicable for detection of the virus in respiratory samples by DFA. Results from analysis of respiratory samples using the duplex real-time RT-PCR assays were compared with those obtained with DFA and the Respiratory Viral Panel (RVP) Fast test, a bead-based suspension microarray test evaluated for routine diagnosis. The RVP Fast assay and PCR showed similar detection rates, except for HEV/HRV, for which a higher detection rate by RVP was observed. All PCR-based assays presented more findings of their target viruses than DFA. The broad detection range of the RVP Fast assay resulted in a nearly threefold overall detection rate, compared with that by DFA. Moreover, analysis of clinical samples resulted in a notable prevalence of hMPV and non-SARS-hCoVs, which emphasizes the role of these viruses as respiratory pathogens. Although the RVP Fast assay demonstrated adequate overall performance, doubts were raised on the ability of the test to detect the H1N1 2009 influenza A virus and all AdV serotypes. Evaluation of the RVP Fast assay demonstrated the remarkable increase in overall viral detection rate that results from adapting a PCR-based multiplex assay to virus diagnostics. The sensitive detection of all the viruses of clinical relevance facilitates efficient infection control measures and appropriate patient management and enables systematic studies on the clinical importance of coinfections. Moreover, collection of data on occurrence of all the viruses of clinical relevance will enable a better understanding of the seasonality, geographical distribution and risk groups of the viral pathogens.Picornavirusten suku käsittää monia ihmiselle patogeeneja viruksia. Ihmisen enterovirukset (HEV) aiheuttavat lukuisia tautitiloja, kuten poliomyeliittiä, enkefalomyeliittiä, hengitystieinfektioita ja ihottumia. Ihmisen rinovirukset (HRV) ovat yleisin flunssan aiheuttaja. Ihmisen parechovirusta (HPeV) ja Aichi virusta (AV) tavataan lähinnä gastroenteriiteissa ja hepatiitti A virus (HAV) aiheuttaa hyväennusteista hepatiittia. Entero- ja rinovirusten lisäksi suuri joukko viruksia aiheuttaa hengitystieinfektioita. Perinteisiä hengitystieviruksia ovat influenssavirukset, respiratory syncytial virus (RSV), adenovirus (AdV), parainfluenssavirukset (PIV) ja ihmisen koronavirukset (hCoV) OC43 ja 229E. Lisäksi 2000-luvulla on löydetty joukko uusia hengitystiepatogeeneja viruksia, kuten ihmisen metapneumovirus (hMPV), severe acute respiratory syndrome -koronavirus (SARS-CoV), ja ihmisen koronavirukset (hCoV) HKU1 ja NL63. Myös ihmisen bokaviruksen (hBoV) rooli todellisena hengitystiepatogeenina on saanut vahvistusta. Koska monet tautitilat voivat olla usean eri viruksen aiheuttamia, on usean viruksen nukleiinihappojen osoittaminen näytteestä samanaikaisesti multiplex testien avulla yleistynyt. Virusten nukleiinihappojen osoittaminen reaaliaikaisilla multiplex polymeraasiketjureaktioon (PCR) perustuvilla testeillä mahdollistaa testitulosten nopean saatavuuden ilman monistustuotteiden käsittelyä. Koska monistustehokkuuden aleneminen käytettäessä useita alukepareja ja koettimia rajoittaa reaaliaikaisen PCR:n käyttöä usean viruksen osoittamiseen, on erillisen monistus- ja hybridisaatioreaktion käyttö uudelleen yleistynyt laajennettaessa testien kattavuutta. Käytettäessä tällaista lähestymistapaa voidaan monistustuotteiden spesifiin osoittamiseen hyödyntää mikrosirutestejä, joilla on suuri kapasiteetti eri monistustuotteiden spesifiin osoittamiseen PCR-reaktioseoksesta. Tässä tutkimuksessa kehitettiin multiplex RT-PCR -monistukseen ja liuoshybridisaatioon perustuva testi HEV, HRV, HPeV ja AV osoittamiseksi. Lisäksi optimoitiin vastaava erillinen testi HAV osoittamiseksi. Ulostenäytteiden analyysissä multiplex RT-PCR testillä löydettiin yksi HPeV-positiivinen näyte. Tulos vastaa hyvin nykykäsitystä, jonka mukaan HPeV ja AV ovat suhteellisen harvinaisia gastroenteriitin aiheuttajia. Tutkimuksessa kehitettiin edelleen reaaliaikainen multiplex RT-PCR -testi, joka mahdollisti entero- ja rinovirusten nopeamman osoittamisen. RSV-osoituksen herkkyyden lisäämiseksi ja hMPV:n samanaikaiseksi osoittamiseksi optimoitiin reaaliaikainen multiplex RT-PCR -testi näiden virusten osoittamiseen. Molemmat reaaliaikaiset RT-PCR -testit olivat luotettavia ja herkkiä kohdevirustensa osoittamisessa, paitsi HRV-osoituksessa, missä heräsi epäilys testin kyvystä osoittaa kaikkia rinoviruksia. Lisäksi kahden kaupallisen hMPV-vasta-aineen todettiin soveltuvan suoraan virusantigeeniosoitukseen hengitystienäytteistä. Hengitystienäytteiden tutkimisesta multiplex RT-PCR testeillä saatuja tuloksia verrattiin virusantigeeniosoituksen tuloksiin ja evaluoitiin RVP Fast liuosmikrosirutesti. Positiivisten löydösten prevalenssi RVP Fast testillä ja reaaliaikaisilla RT-PCR testeillä oli samansuuruinen, paitsi HEV/HRV löydösten määrä, joka oli RVP:lla oli suurempi. Kaikki PCR-perusteiset testit osoittivat virusantigeeniosoitusta enemmän kohdeviruksia. RVP Fast testin suuri kohdevirusten määrä johti lähes kolminkertaiseen detektioprevalenssiin virusantigeeniosoitukseen verrattuna. Potilasnäytteistä merkittävä osa oli positiivisia hMPV:n ja non-SARS-koronavirusten suhteen, mikä korostaa näiden virusten merkitystä hengitystieinfektioiden aiheuttajina. RVP Fast testin toiminta osoittautui yleisesti ottaen luotettavaksi, mutta epäilys heräsi testin kyvystä osoittaa influenssa A viruksen H1N1 (2009) tyyppiä sekä kaikkia adenovirusserotyyppejä. RVP Fast testin evaluaatio osoitti, että PCR-perustaisen multiplex testin käyttöönotto johtaa positiivisten löydösten määrän merkittävään lisääntymiseen virusantigeeniosoitukseen verrattuna. Kaikkien kliinisesti merkittävien virusten osoittaminen mahdollistaa tehokkaan infektiotautien torjunnan ja asianmukaisen hoidon sekä luo puitteet koinfektioiden kliinisen merkityksen systemaattiselle tutkimiselle. Lisäksi kaikkien kliinisesti merkittävien virusten löydösten huomioiminen johtaa parempaan käsitykseen näiden patogeenien kausivaihtelusta, maantieteellisestä esiintyvyydestä ja riskiryhmistä.
Subject: yleinen mikrobiologia
virologia
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
multiple.pdf 783.7Kb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record