CRISPR/CAS9 MEDIATED KNOCKDOWN OF SELECTED GDNF/RET PATHWAY PROTEINS TO STUDY THEIR EFFECTS ON α-SYNUCLEIN AGGREGATION IN PRIMARY DOPAMINERGIC MOUSE NEURONS

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202108233490
Title: CRISPR/CAS9 MEDIATED KNOCKDOWN OF SELECTED GDNF/RET PATHWAY PROTEINS TO STUDY THEIR EFFECTS ON α-SYNUCLEIN AGGREGATION IN PRIMARY DOPAMINERGIC MOUSE NEURONS
Author: Hakosalo, Vili
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2021
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202108233490
http://hdl.handle.net/10138/333406
Thesis level: master's thesis
Degree program: Genetiikan ja molekulaaristen biotieteiden maisteriohjelma
Master's Programme in Genetics and Molecular Biosciences
Magisterprogrammet i genetik och molekylära biovetenskaper
Specialisation: Biokemia ja rakennebiologia
Biochemistry and Structural biology
Biokemi och strukturbiologi
Abstract: Parkinsonin tauti on toiseksi yleisin ihmisillä esiintyvä neurodegeneratiivinen sairaus. Parkinsonin tautiin ei ole vielä olemassa lääkettä, joka parantaisi tai pysäyttäisi taudin etenemisen. Gliasolujohdannainen hermokasvutekijä GDNF (engl. glial cell line-derived neurotrophic factor) on potentiaalinen lääke pysäyttämään Parkinsonin taudin etenemisen sairastuneilla potilailla. GDNF:llä on monia hermosoluja suojaavia ominaisuuksia, joista yksi tärkeimmistä on dopamiinisia hermosoluja ylläpitävä ominaisuus. Dopamiiniset hermosolut ovat kriittisin hermosolupopulaatio Parkinsonin taudissa, sillä ne alkavat heikentyä ja kuolla taudin edetessä. Uusimman tiedon mukaan, GDNF pystyy vaikuttamaan myös fosforyloituneen α-synukleiinin määrään dopamiinisissa hermosoluissa in vitro kokeissa. Fosforyloitu α-synukleiini on keskeinen tekijä sekä neurodegeneratiivissa taudeissa yleisesti, että Parkinsonin taudin potilaista löydetyissä solunsisäisissä patologisissa kertymissä, joita kutsutaan Lewyn kappaleiksi. Tyrosiinikinaasireseptori (RET) on GDNF:n pääreseptori, joka aktivoi toisiosignaaliketjuja solun sisällä GDNF:n vaikutuksesta. RET on myös kriittinen tekijä GDNF:n hyvinvointia edistävissä ominaisuuksissa, sillä RET:n poistaminen myös poistaa GDNF:n vaikutuksen. Eri toisiosignaaliketjujen ja yksittäisten molekyylien merkitystä on jo tutkittu käyttäen farmakologisia inhibiittoreita, mutta geneettisten mallien käyttöä ei tule väheksyä. Nämä mallit ovat usein tarkempia poistamaan halutun proteiinin vaikutus hiljentämällä tai poistamalla proteiinia koodaavaa geeni. Geneettiseksi työkaluksi luotu CRISPR/Cas9 on täysin uudistanut geeniteknologian alaa. Sen yksityiskohtainen tarkkuus, helppo muokattavuus tutkimusasetelmaan sopivaksi sekä mahdollinen ilmennettävyys eri organismeissa on johtanut sen käytön yleistymiseen geeniteknologiaa hyödyntävissä tutkimuksissa. CRISPR/Cas9-menetelmää käytettiin myös tässä tutkimuksessa poistamaan valittujen geenien ilmentyminen. CRISPR/Cas9 pakattiin lentivirusvektoreiden sisään, jotka transduktoivat dopamiinisia hermosoluja in vitro tässä tutkimuksessa. Haluttuihin geeneihin suunnitellut ohjaus-RNA-juosteet (CRISPR) sekä Cas9-endonukleaasigeeni integroituvat isäntäsolun sisälle. Nämä molekyylit leikkaavat haluttua genomin kohtaa ohjausjuosteen avulla. Tässä tutkimuksessa Parkinsonin tautia mallinnettiin aiheuttamalla fosforyloituja α-synukleiinikertymiä solun sisälle käyttäen ennalta luotuja proteiinifilamentteja (engl. PFF), jotka on katkaistu eri pituisiksi käyttäen ultraääntä. Solun ulkopuolelle asetettuna PFF:t toimivat malleina solun sisäisille α-synukleiineille, jotka alkavat spontaanisti aggregoitumaan. Solukasvustoina käytettiin primäärisiä dopamiinisia hermosoluja, jotka oli kirurgisesti eristetty E13.5 ikäisistä hiiren alkioista ja viljelty 96-kuoppalevylle. Tutkimusasetelman lopuksi levyt värjättiin vasta-aineilla ja kuvattiin. Kuvatut levyt myös analysoitiin käyttäen Cell profiler -solunanalysointiohjelmistoja. Tässä tutkimuksessa esitetään, kuinka eri geenit ovat kytköksissä GDNF/RET signalointiin, sekä niiden merkitys yksittäin tarkasteltuna fosforyloituneen α-synukleiinin määrään Parkinsonin tautia kuvaavissa Lewyn kappaleen omaisissa kertymissä.Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurogenerative disease. There are no drugs available to halt the progression of PD. The glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) has been identified as a potential drug candidate against PD because of its protective properties on dopaminergic neurons, which are an especially vulnerable cell population in PD. It has been recently shown that GDNF can also attenuate aggregation of phosphorylated α-synuclein in dopaminergic neurons, which is one of the most important pathologies of PD. Phosphorylated α-synuclein is a primary component of Lewy bodies, which in turn, are vastly studied intracellular inclusions with a high correlation towards neurodegenerative diseases. GDNF signals through its main receptor RET and activates downstream signalling cascades. RET is indispensable for the effect of GDNF against α-synuclein aggregation. Importance of the downstream molecules Src, AKT and PI3K have been also pharmacologically demonstrated. However, complete mechanism of GNDF’s action and individual importance of downstream signalling molecules has been yet to establish. CRISPR/Cas9 gene editing tool has revolutionized the gene manipulation in biological research. In this thesis work, CRISPR/Cas9 guides were designed to target and mutate the c-Src, Akt1 and NURR1, which are important proteins of the GDNF/RET pathway. As a delivery system for the Cas9 enzyme and individual guides, lentiviral vectors were produced according to the protocols previously established in our laboratory and proved to be high efficiency. Modelling of α-synuclein aggregation in neurons was performed with pre-formed fibrils of α-synuclein, which induce the formation of intracellular Lewy body-like inclusions with the phosphorylation of α-synuclein at serine 129. In this study, primary dopaminergic neuron cultures from E13.5 mouse embryos were cultured in 96-well plates. For each of the target genes, I designed two guide variants, cloned them in lentiviral transfer vectors and produced lentiviral particles for neuronal transduction. My data shows that targeting Akt1 and c-Src impaired the protective mechanism of GDNF against Lewy body-like inclusions. For the importance of NURR1 more studies are needed for coherent conclusions. I also showed that targeting of NURR1 impaired the GDNF/RET signalling at least in one guide construct. The 15-day long cultivation did not affect to the dopaminergic cell numbers in any of the groups. Still the confirmation of successful CRISPR-induced genetic mutations by sequencing as well as the detailed mechanism of how GDNF prevents the formation of Lewy body-like inclusions will be a subject of future studies. This thesis provides important information for the molecular mechanism of attenuation of α-synuclein aggregation by GDNF through its main receptor RET.
Subject: GDNF
RET
Parkinson’s disease
Lewy body α-synuclein Pre-formed fibrils CRISPR/Cas9 primary dopaminergic neurons
Full text embargoed until: 2023-06-30


Files in this item

Files Size Format View

Embargo on files ends: 2023-06-30

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record