Molecular and cellular basis of early development of the mammary gland

Abstract

The mammary gland, a specialized organ providing nutrition for mammalian offspring, commences during embryogenesis with the formation of an epithelial thickening known as, placode. Subsequently, the placode enlarges creating a hillock and invaginates into underlying mesenchyme, marking the transition to a bulb stage. By the time of birth, the primary rudimentary ductal tree forms through branching morphogenesis. The development of the organ continues postnatally, and its full maturation is accomplished during pregnancy and lactation. Signaling pathways involved in mammogenesis are well characterized. Among them ectodysplasin (Eda) is key regulator of ectodermal appendages formation in all vertebrates. Eda belongs to tumor necrosis factor family and mediates signaling through transcription factor NF-κB. In humans, mutations in Eda or other components of this signaling pathway lead to hypohidrotic ectodermal dysplasia (HED), characterized by sparse hair, missing teeth, and defects in several exocrine glands including the breast. Mice overexpressing Eda (K14-Eda) exhibit supernumerary mammary glands and a hyperbranching phenotype. Despite growing knowledge on molecular signaling regulating mammogenesis, cellular mechanisms are still poorly characterized. The aim of this thesis work was to uncover how Eda regulates mammary gland development and to identify the key cellular mechanisms driving mammary bud formation.

In this thesis work, molecular and cellular mechanisms of early mammary gland development were studied. The transcriptional target genes of Eda were identified, among them members of Wnt, Fgf, TNF, Tgfβ, chemokine and Hh signaling pathways. It was shown that in K14-Eda mice supernumerary glands also formed in the neck region, whereas formation of ectopic mammary placodes on the flank was mediated through Eda-dependent Wnt pathway upregulation. Using the Fgf20 null mouse model the role of Eda target gene, Fgf20 in mammogenesis was studied. Results showed that while Fgf20 is dispensable for mammary placode formation, its depletion led to the bud size defect. Cellular mechanisms driving early mammary primordium development were elucidated using 3D and 4D confocal microscopy. It was shown that early mammary rudiment growth is predominantly mediated through migration-driven cell influx, with cell hypertrophy and cell proliferation making minor contributions in this process. Additionally, cell migration in the mammary placode stage was documented by live imaging for the first time. The invagination of the mammary bud was shown to be mediated through contractile rim of epidermal keratinocytes adjacent to the bud, named ring cells. Conditional deletion of Myh9, encoding heavy chain of non-muscle myosin IIA, led to decreased actomyosin network and a compromised ring cell shape indicative of their impaired function. In addition, abnormal mammary bud shape and defective invagination was observed suggesting an essential role of NMIIA in this process.

Maitorauhanen on pitkälle erikoistunut avoeritteinen rauhanen, joka tuottaa ravintoa nisäkkäiden imeväisille. Maitorauhasen kehitys alkaa, kun sikiön ektodermaaliseen epiteelikudokseen muodostuu paksuuntuma eli plakodi (”placode”). Plakodi suurenee kumpareeksi (”hillock”) ja tunkeutuu alla olevaan mesenkyymiin alkaen muistuttaa ensin muodoltaan silmua (”bud”) ja sitten hehkulamppua (”bulb”). Tämän jälkeen maitorauhanen alkaa haaroittua ja syntymään mennessä muodostuu alkeellinen rauhaspuun rakenne. Maitorauhasen kehitys jatkuu syntymän jälkeen ja saavuttaa täyden toimintavalmiutensa raskauden ja imetyksen aikana. Maitorauhasen kehitystä ohjaavat signaalinvälitysketjut on hyvin karakterisoitu. Niihin lukeutuu ektodysplasiini (Eda), joka on ektodermaalisten elinten kehityksen keskeinen säätelytekijä selkärankaisissa. Eda kuuluu tuumorinekroositekijäperheeseen (TNF) ja sen käynnistämä signaalinvälitysketju säätelee NF-κB transkriptiotekijän kohdegeenien ilmentymistä. Mutaatiot Eda:ssa tai muissa signaalivälitysketjun osasissa aiheuttaa geneettisen sairauden nimeltä hypohidroottinen ektodermaalinen dysplasia (HED), joka ilmenee heikkona hiusten ja karvojen kasvuna, puuttuvina hampaina ja puutteina rauhasten toiminnassa, rintarauhanen mukaan luettuna. Eda:n yli-ilmentäminen hiirissä (K14-Eda) johtaa ylimääräisten maitorauhasten muodostumiseen, sekä liialliseen kasvuun ja haaroittumiseen. Vaikka tietous maitorauhasen kehityksen molekyylisäätelystä on lisääntynyt, ovat sen solumekanismit verrattain heikosti ymmärretty. Tämän väitöskirjatutkimuksen tavoitteena oli selvittää miten Eda signaalipolku säätelee maitorauhasen kehitystä ja tunnistaa maitorauhasen varhaiskehitystä ohjaavat solubiologiset mekanismit.

Tässä väitöskirjassa tutkittiin maitorauhasen varhaiskehityksen molekyyli- ja solumekanismeja. Eda:n kohdegeeneiksi tunnistettiin Wnt, Fgf, TNF, Transformoiva kasvutekijä β, kemokiini ja Hedgehog -signaalinvälitysketjujen osasia. K14-Eda hiirimallissa havaittiin, että kaulalle muodostui ylimääräisiä maitorauhasplakodeja ja osoitettiin ylimääräisten plakodien syntyvän Wnt signaalinvälitysketjun aktiivisuuden seurauksena. Eräs löydetyistä Eda:n kohdegeeneistä oli Fgf20, jonka roolia tutkittiin tarkemmin poistogeenisessä hiirilinjassa. Fgf20 ei ollut välttämätön plakodien muodostukselle, mutta maitorauhasten silmut ovat normaalia pienempiä. Tutkin myös maitorauhasen muodostumisen solumekanismeja kolmi- ja neliulotteisella (so. elävän kudoksen aikaviivekuvantamisella) konfokaalimikroskopialla. Näytin ensi kertaa eläviä soluja kuvantamalla, että maitorauhasaihion varhainen kasvu on seurausta solujen liikkeestä. Solujen koon kasvulla ja solujakautumisella sen sijaan oli pienempi vaikutus. Maitorauhassilmun työntyminen alla olevaan mesenkyymiin oli riippuvainen sitä reunustavista ektodermin epiteelisoluista (keratinosyyteistä), jotka muodostivat supistuvan kehän sen ympärille. Supistuvan kehän merkitys kävi selväksi tutkimalla hiirten sikiöitä, joiden ei-lihasperäisen myosiini-IIA:n (NMIIA) raskasta ketjua koodaava Myh9 -geeni oli inaktivoitu ektodermissä. Myh9:n puute johti kehäsolujen aktiini-myosiini-verkoston heikkenemiseen ja niiden muotojen pyöristymiseen. Lisäksi havaitsin maitorauhassilmun muotoutumisen ja mesenkyymiin työntymisen olevan puutteellista, mikä osoitti NMIIA:n tärkeän roolin varhaisessa maitorauhasen kehityksessä.