Investigation of Bacterial Biofilms on Clinically Relevant Materials and Effects of Antimicrobials

Näytä kaikki kuvailutiedot



Pysyväisosoite

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-7457-4
Julkaisun nimi: Investigation of Bacterial Biofilms on Clinically Relevant Materials and Effects of Antimicrobials
Tekijä: Hiltunen, Anna Katariina
Muu tekijä: Helsingin yliopisto, farmasian tiedekunta
Lääketutkimuksen tohtoriohjelma
Julkaisija: Helsingin yliopisto
Päiväys: 2021-09-24
Kieli: en
Kuuluu julkaisusarjaan: Dissertationes Scholae Doctoralis Ad Sanitatem Investigandam Universitatis Helsinkiensis - URN:ISSN:2342-317X
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-7457-4
http://hdl.handle.net/10138/333954
Opinnäytteen taso: Väitöskirja (artikkeli)
Tiivistelmä: Biofilm, a major lifestyle of bacteria, refers to bacterial communities surrounded by a self-produced protective slimy matrix. Due to this matrix and the reduced metabolic activity of bacteria within them, biofilms usually withstand the eradication of conventional antibiotics, leading to recalcitrant and recurrent infections. Therefore, there is an immense need for discovering novel truly effective anti-biofilm treatment strategies that do not promote the development of antibiotic resistance. Biofilms colonizing permanently inserted indwelling medical devices are particularly challenging as their eradication always requires some kind of invasive surgery. Even though a wide variety of biomaterials are used in medical devices, the thorough understanding of biofilm characteristics or formation on such materials is still limited. In this thesis, a multidimensional orthogonal approach was taken to characterize biofilm dynamics on different biomaterials (borosilicate glass, plexiglass, hydroxyapatite, titanium, and polystyrene) at different maturation points (18, 42, and 66 h) (study I). This study covered (i) biomaterial surface properties (and the correlation with material susceptibility to biofilm formation), (ii) biofilm matrix structures (via proteosurfaceomics and polysaccharide/protein content determinations), and (iii) biofilm functionality (antimicrobial tolerance studies). Staphylococcus aureus, which is a major pathogen in medical device-associated infections, was chosen as a model organism for this study. The matrix-associated polysaccharide content was observed to play an important role in the initial stages of biofilm formation as its amount decreased towards the end of the observation period. In turn, the matrix-associated protein content seemed to increase over time. Interestingly, the classical surface proteins that have been deemed as the most attractive targets in antibiotic development, demonstrated high biomaterial-dependent variability in their amounts. In turn, the presence of non-classical surface proteins “moonlighting proteins”, forming the major portion of the core proteosurfaceome, did not appear to be strongly dependent on the material. It is known that biofilm inhabitants reutilize cytoplasmic proteins as moonlighting constituents in the extracellular space, offering enhanced bacterial attachment, virulence, and antibiotic tolerance. Therefore, inhibiting moonlighting activity would offer a novel target for anti-biofilm agent/material development. Finally, biofilms formed on hydroxyapatite were in many cases more susceptible to antibiotics than titanium-associated biofilms. Also, according to our findings, the biofilm age did not always correlate with the increased antibiotic tolerance. To the best of our knowledge, study I is among the pioneer investigations shedding light onto the matrix-associated proteosurfaceomes of S. aureus biofilms developed on different biomaterials and at diverse biofilm formation points. The study offers further mechanistic insights into biofilm formation and the findings may facilitate the development of new anti-biofilm compounds. After focusing on the more fundamental aspects of biofilm formation on different materials, the next goal was to study whether one of these biomaterials, hydroxyapatite, could be protected from biofilm colonization with a novel non-antibiotic combination product. This was studied in two in vitro biofilm infection models: for prosthetic joint infections (PJIs) (modelled using S. aureus and Staphylococcus epidermidis; study II) and periodontitis (using Aggregatibacter actinomycetemcomitans; study III). Both diseases cause significant individual burden and would benefit from an approach with both biofilm-eradicating and bone-preserving capabilities. The rise of antibiotic resistance is a top threat to public health, and thus innovative treatment options reducing the use of conventional antibiotics are desired. Based on this, bioactive glass S53P4 (BAG), a bone-constructing material with a completely divergent (i.e. physical-based) bactericidal mechanism, was chosen as a focus here. Additionally, it has been previously reported that the bone construction ability of other bioactive glasses can be enhanced by combining them with anti-osteoporotic drugs, i.e. bisphosphonates (BPs). However, how the addition of BPs (alendronate, clodronate, etidronate, risedronate, and zoledronate) influences the anti-biofilm effect of BAG has not been previously studied, and this was the main research question in studies II and III. Etidronate-BAG and risedronate-BAG were found to be the most promising combinations from the perspective of both studies (II and III), while clodronate-BAG was not effective against any of the strains. Risedronate was the only BP that had an intrinsic anti-biofilm effect against all the tested strains. Moreover, an enhanced anti-biofilm effect was systematically observed in study III, probably due to the longer treatment period (48 h) compared to the one used in study II (24 h). Finally, a possible mechanistic perspective to the anti-biofilm effect of BP-BAG combinations was undertaken. The observed anti-biofilm effects could not be rationalized alone with lowered pH values. Increased osmotic pressure or another yet-unknown mechanism seems to contribute to the observed anti-biofilm effect. In conclusion, the results of studies II and III further support the use of the most effective BP-BAG combinations in protecting biomaterials from biofilm infections in PJI and periodontal applications.  Biofilmi on bakteerien yleisin kasvutapa, ja sillä tarkoitetaan bakteeriyhdyskuntia, joita ympäröi bakteerin tuottama suojaava limamatriisi. Tästä limamatriisista ja bakteerien vähäisestä metabolisesta aktiivisuudesta johtuen tavanomaiset antibiootit osoittautuvat yleensä tehottomiksi biofilmi-infektioiden hoidossa. Seurauksena tästä voi syntyä sitkeitä ja toistuvia infektioita. Onkin suuri tarve löytää uusia aidosti tehokkaita biofilmien vastaisia hoitostrategioita, jotka eivät kuitenkaan edistäisi antibioottiresistenssin kehittymistä. Biofilmit, jotka muodostuvat elimistön sisään pysyvästi asennetuille lääkinnällisille laitteille, ovat erityisen haastavia, koska niiden hävittäminen vaatii aina jonkinlaisen invasiivisen leikkauksen. Vaikka lääkinnällisissä laitteissa käytetään monenlaisia biomateriaaleja, perusteellinen ymmärrys biofilmien ominaisuuksista ja muodostumisesta näille materiaaleille on edelleen rajallista. Tässä väitöskirjassa hyödynnettiin moniulotteista ortogonaalista lähestymistapaa analysoitaessa eri-ikäisten (18, 42 ja 66 h) biofilmien dynamiikkaa eri biomateriaaleilla (borosilikaattilasi, pleksilasi, hydroksiapatiitti, titaani ja polystyreeni) (tutkimus I). Tämä tutkimus käsitti (i) näiden materiaalin pintaominaisuuksien määrittämisen, sekä analyysin ominaisuuksien korrelaatiosta biofilmin muodostumisherkkyyden kanssa. Seuraavaksi, (ii) näiden eri materiaaleille muodostettujen ja eri-ikäisten biofilmien matriisikoostumukset analysoitiin (käsittäen proteiinisurfaseomien ja polysakkaridi-/proteiinipitoisuuksien määritykset). Lopuksi tutkittiin (iii) eroavatko eri materiaaleille muodostuneet ja eri-ikäiset biofilmit antibioottivastustuskyvyn suhteen. Staphylococcus aureus on merkittävä taudinaiheuttaja lääkinnällisiin laitteisiin liittyvissä infektioissa, ja se valittiin malliorganismiksi tähän tutkimukseen. Matriisin polysakkaridien havaittiin olevan tärkeässä roolissa biofilmin muodostumisen alkuvaiheessa, ja niiden määrät vähenivät tarkkailujakson edetessä. Matriisiin proteiinipitoisuus puolestaan näytti kasvavan ajan kuluessa. Perinteisesti houkuttelevina antibioottikehityskohteina pidettyjen klassisten pintaproteiinien määrät osoittautuivat olevan riippuvaisia käytetystä biomateriaalista. Ei-klassisten pintaproteiinien, nk. ”monitoimijaproteiinien” (eng. moonlighting proteins) määrät eivät puolestaan näyttäneet olevan voimakkaasti riippuvaisia käytetystä materiaalista. Nämä monitoimijaproteiinit muodostivat myös suurimman osan ydinproteiinisurfaseomista. Tiedetään, että biofilmipopulaatio hyödyntää ensin näitä monitoimijaproteiineja sytoplasmassa, jonka jälkeen ne siirtyvät uudiskäyttöön solunulkoiseen tilaan. Solunulkoisessa tilassa ne edistävät bakteerien kiinnittymis-, taudinaiheuttamis- ja antibioottien vastaista puolustautumiskykyä. Tämän monitoimi-ilmiön estäminen voisikin toimia uutena kohteena biofilmin vastaisten lääkeaineiden/materiaalien kehityksessä. Lopuksi havaittiin, että hydroksiapatiitille muodostuneet biofilmit olivat monissa tapauksissa herkempiä antibiooteille kuin titaanille muodostuneet biofilmit. Havaintojemme mukaan myöskään biofilmin ikä ei aina korreloinut lisääntyneen antibioottivastustuskyvyn kanssa. Parhaan tietomme mukaan tutkimus I toimii edelläkävijänä valaisten S. aureus-biofilmimatriisien proteiinisurfaseomien koostumuksia, kun eri ikäisiä biofilmejä on muodostettu eri biomateriaaleille. Tutkimus tarjoaa uudenlaisia näkemyksiä koskien biofilmin muodostumista, ja nämä havainnot voivat helpottaa uusien biofilmien vastaisten yhdisteiden kehitystyötä. Näiden perustavanlaatuisten muodostumistutkimusten jälkeen seuraavana tavoitteena oli tutkia, voisiko yhtä näistä biomateriaaleista, hydroksiapatiittia, suojata biofilmin muodostumiselta uudentyyppisellä antibiootittomalla yhdistelmätuotteella. Tätä tutkittiin kahdessa in vitro biofilmi-infektiomallissa: nivelproteesi-infektiomallissa (S. aureus- ja Staphylococcus epidermidis-bakteereja vastaan; tutkimus II) ja parodontiittimallissa (Aggregatibacter actinomycetemcomitans-bakteeria vastaan; tutkimus III). Molemmat sairaudet aiheuttavat yksilölle merkittävää kuormitusta ja niissä hyödyttäisiin hoitomuodosta, jossa yhdistyisivät sekä biofilmejä tuhoavat, että luuta ylläpitävät omaisuudet. Antibioottiresistenssin nousu on merkittävä uhka kansanterveydelle, ja siksi on tarvetta innovatiivisille hoitovaihtoehdoille, jotka vähentävät tavanomaisten antibioottien käyttöä. Siksi luunrakennusmateriaali (bioaktiivinen lasi S53P4; BAG), jolla on täysin poikkeava fysikaalinen bakteereja tappava mekanismi, valittiin näiden tutkimusten keskiöön. Aiempien raporttien mukaan joidenkin bioaktiivisten lasilaatujen luurakentamiskykyä voidaan parantaa osteoporoosilääkkeillä eli bisfosfonaateilla. Kuitenkaan sitä kuinka bisfosfonaattien (alendronaatti, klodronaatti, etidronaatti, risedronaatti ja tsoledronaatti) lisääminen vaikuttaa BAG:n biofilmien vastaiseen tehoon, ei ole aiemmin tutkittu. Tämä toimikin pääasiallisena tutkimuskysymyksenä tutkimuksille II ja III. Etidronaatti-BAG ja risedronaatti-BAG todettiin lupaavimmiksi biofilmien vastaisiksi yhdistelmiksi molempien tutkimusten (II ja III) näkökulmasta, kun taas klodronaatti-BAG ei ollut tehokas mitään tutkittua bakteerikantaa vastaan. Risedronaatti oli ainoa bisfosfonaatti, jolla oli biofilmien vastainen vaikutus yksinään annosteltuna; vaikutus myös ilmeni kaikkia testattuja bakteerikantoja vastaan. Lisäksi biofilmien vastainen teho havaittiin olevan järjestelmällisesti parempi tutkimuksessa III, todennäköisesti johtuen pidemmästä hoitojaksosta (48 h) verrattuna tutkimuksessa II käytettyyn (24 h). Lopuksi annoimme näkökulman selittämään bisfosfonaatti-BAG-yhdistelmien biofilmien vastaisia vaikutuksia. Havaittuja vaikutuksia ei voitu selittää yksinään laskeneilla pH-arvoilla. Kohonnut osmoottinen paine tai muu vielä tuntematon mekanismi näyttääkin osallistuvan tähän. Yhteenvetona voidaan todeta, että tutkimusten II ja III tulokset tukevat tehokkaimpien bisfosfonaatti-BAG-yhdistelmien käyttöä biomateriaalien suojaamisessa biofilmi-infektioilta nivelproteesi-infektio- ja parodontiitti-indikaatioissa.
Avainsanat: farmasia
Tekijänoikeustiedot: Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.


Tiedostot

Latausmäärä yhteensä: Ladataan...

Tiedosto(t) Koko Formaatti Näytä
hiltunen_anna_dissertation_2021.pdf 2.441MB PDF Avaa tiedosto

Viite kuuluu kokoelmiin:

Näytä kaikki kuvailutiedot