Tissue-specific genetic and epigenetic alterations in Mlh1 heterozygous tissues

Abstract

Mismatch repair (MMR) proteins are involved in maintaining genome integrity in somatic and germline cells. Defects in MMR leads to various abnormalities, such as tumorigenesis in Lynch syndrome (LS) and infertility. MLH1 (a central MMR protein) along with other MMR proteins are involved in repair of replication-induced errors arising due to inaccurate DNA polymerase. If unrepaired (due to defective MMR), these errors accumulate and give rise to a cellular phenotype known as microsatellite instability (MSI). MSI is a hallmark of tumors associated with LS and results from complete loss of MMR; LS patients have high incidence of colorectal cancer.

It is still poorly understood why certain tissues in LS, in particular the gastrointestinal (GI) tract, are more vulnerable to MSI-associated tumors. Also, how heterozygosity of MMR genes impact the germline genomic integrity is not known. We hypothesized that certain tissues, in particular those with high proliferating rates, are vulnerable to MMR associated abnormalities compromising microsatellite stability (prior to complete loss of MMR function) in a tissue-specific manner before tumorigenesis. Our aim was to understand how MMR protein levels contribute to MSI in vivo.

In the research presented here, we used Mlh1 heterozygous mice (Mlh1+/- mice) as model of LS to investigate how decreased MLH1 levels contribute to tissue-specific MSI, and whether MSI is detectable prior to loss of MMR function and to neoplastic growth. We tested MSI and measured MLH1 levels in primary cells derived from different organs, focusing on the comparison between highly proliferating small intestine and low proliferating spleen. Further, we tested MSI in sperm cells of Mlh1+/- mice. In addition, we studied the association of loss of heterozygosity (LOH) and Mlh1 promoter methylation to tissue-specific MLH1 expression and MSI. The studies were conducted at 4- and 12-month time point.

We discovered that highly proliferating normal tissues (small intestine and sperm) of Mlh1+/- mice display MSI which increases with age, while low proliferating spleen was microsatellite stable. Further, Mlh1+/- small intestine showed sporadic decrease in MLH1 levels which associated with the observed MSI, while Mlh1+/- spleens showed expected MLH1 expression (i.e. approximately 50% of wildtype expression). We observed soma-wide Mlh1 promoter methylation in a subset of Mlh1+/- mice; these mice were the most vulnerable to MLH1 expression level decrease and to MSI in the small intestine, while MLH1 expression in other somatic tissues remained unaffected. In brief, we showed that normal small intestine of Mlh1+/- mice is particularly susceptible to MLH1 depletion giving rise to MSI long before neoplasia. Further, we demonstrated that Mlh1+/- sperm exhibit MSI which associates with germline Mlh1 promoter methylation.

DNA:n kahdentumisvirheiden korjaukseen (engl. mismatch repair, MMR) osallistuvat proteiinit pitävät yllä genomin eheyttä. Puutteet MMR-proteiinien toiminnassa johtavat moninaisiin poikkeavuuksiin, kuten syövän syntyyn Lynchin oireyhtymässä ja hedelmättömyyteen. MLH1-proteiini, jolla on keskeinen rooli MMR:ssä, osallistuu DNA:n kahdentumisvirheiden korjaamiseen, jotka syntyvät, kun DNA-polymeraasi kopioi genomista sekvenssiä epätarkasti. Jos virheet jäävät korjaamatta toimimattoman MMR:n vuoksi, ne kertyvät soluihin aiheuttaen ilmiasun, jota kutsutaan mikrosatelliittien epävakaudeksi (engl. microsatellite instability, MSI). Täydellisestä MMR-puutoksesta johtuva MSI on tunnusomaista Lynchin oireyhtymään (Lynch syndrome, LS) liittyville syöpäkasvaimille; LS-potilailla on korkea paksusuolen syövän ilmaantuvuus.

Edelleen ymmärretään huonosti, miksi LS:ssa vain tietyt kudokset, erityisesti ruuansulatuskanavan kudokset, ovat alttiimpia mikrosatelliittien epävakaudelle ja siihen liittyville kasvaimille. Lisäksi ei ole tiedossa, miten MMR-geenien heterotsygotia vaikuttaa ituradan genomiseen eheyteen. Hypoteesimme oli, että tietyt kudokset, erityisesti voimakkaasti jakautuvat, ovat alttiita MMR:n häiriöille, jotka puolestaan vaarantavat mikrosatelliittien vakauden (ennen MMR:n täydellistä puutosta) kudostyyppikohtaisesti ennen karsinogeneesiä. Tavoitteemme oli ymmärtää miten MMR-proteiinitasot vaikuttavat mikrosatelliittien epävakauteen in vivo.

Tässä tutkimuksessa käytimme Mlh1 heterotsygoottisia hiiriä (Mlh1+/-) Lynchin oireyhtymän mallina selvittääksemme, kuinka alentunut MLH1-proteiinitaso vaikuttaa mikrosatelliittien vakauteen eri kudoksissa, ja onko MSI:tä havaittavissa jo ennen MMR:n toiminnan menettämistä ja solujen hillitsemätöntä kasvua. Määritimme MSI:n ja MLH1-proteiinin tasot eri elimistä peräisin olevista primäärisoluista, vertaamalla nopeasti jakaantuvia ohutsuolen soluja pernan soluihin, jotka jakaantuvat vain harvoin. Lisäksi määritimme, kuinka epävakaita mikrosatelliitit ovat Mlh1+/- hiirten siittiösoluissa. Tutkimme myös, kuinka heterotsygotian menetys (loss of heterozygosity, LOH) ja Mlh1:n promoottorialueen metylaatio liittyvät kudoskohtaiseen MLH1:n ilmentymiseen ja mikrosatelliittien epävakauteen. Tutkimukset suoritettiin 4 ja 12 kuukauden ikäisistä hiiristä kerätyissä kudokssa.

Havaitsimme, että Mlh1+/- -hiirissä, nopeasti jakaantuvien kudosten solut (ohutsuoli ja siittiöt) ilmentävät MSI:tä, joka lisääntyy iän myötä, kun taas hitaasti jakaantuva pernassa mikrosatelliitit pysyivät vakaina. Lisäksi Mlh1+/--hiirten ohutsuolessa esiintyi satunnaista laskua MLH1-proteiinitasoissa ja samoissa näytteissä havaittiin korkeampaa MSI:ta, kun taas Mlh1+/--pernassa MLH1-ekspressiotaso oli odotusten mukainen (eli noin 50 % villityypin tasosta). Osalla Mlh1+/--hiiristä löytyi Mlh1-promoottorialueen metylaatio kaikista tutkituista kudoksista. Nämä hiiret olivat alttiimpia MLH1-tason laskulle ja MSI:lle ohutsuolessa, kun taas MLH1:n ekspressio muissa kudoksissa säilyi ennallaan. Mlh1+/--hiirien normaali ohutsuoli on siis erityisen herkkä MLH1-tason laskulle, mikä johtaa mikrosatelliittien epävakauteen jo kauan ennen kasvainten syntyä. Lisäksi osoitimme, että mikrosatelliitit ovat epävakaita myös Mlh1+/--siittiössä, ja epävakaus assosioi ituradan Mlh1-promoottorialueen metylaation kanssa.