The influence of soluble components and culture conditions on hepatic differentiation of human pluripotent stem cells

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-7638-7
Title: The influence of soluble components and culture conditions on hepatic differentiation of human pluripotent stem cells
Author: Bogacheva, Mariia
Other contributor: Helsingin yliopisto, farmasian tiedekunta
Helsingfors universitet, farmaceutiska fakulteten
University of Helsinki, Faculty of Pharmacy
Lääketutkimuksen tohtoriohjelma
Doktorandprogrammet i läkemedelsforskning
Doctoral Programme in Drug Research
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2021-11-12
Language: en
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-7638-7
http://hdl.handle.net/10138/335486
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Investigation of the hepatotoxicity of therapeutic compounds in vitro before clinical studies requires a reliable human liver cell model. Due to the disadvantages of using primary cell lines, hepatocellular carcinoma cell lines, and animal models, stem cell-derived liver models represent a promising tool for drug testing. Existing stem cell-derived liver models have immature characteristics, causing a demand for deeper investigation and improvements in hepatic differentiation procedures. Hepatocytes, the most abundant cell population in the liver, are responsible for drug metabolism. This feature makes them the most desirable liver cell population for drug testing. Pluripotent stem cell (PSC) differentiation into hepatocytes occurs in a few stages, namely, definitive endoderm (DE), hepatic progenitors (hepatoblasts), fetal hepatocytes, and adult hepatocytes. Each stage is controlled by defined external biochemical signals and physical environmental features provided by the surrounding extracellular matrix (ECM). Successful hepatic differentiation in vitro depends on the ability of the chosen conditions to mimic natural development. The right approach should focus on the assessment of the cellular state at every step of the differentiation. This thesis aimed to develop an effective method for human PSC differentiation into functional hepatocyte-like cells (HLCs) in two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environments via spatially and temporally controlled physical and biochemical cues. First, we compared six previously developed differentiation medium compositions for their effectiveness in PSC differentiation into DE. We conducted differentiation for human induced PSCs (hiPSCs) and human embryonic stem cells (hESCs). We assessed the dynamic effectiveness of the differentiation using different combinations of growth factors (activin A and Wnt-3a) and/or small molecules (sodium butyrate salt and IDE1). We demonstrated activin A to be an efficient and sufficient agent for DE induction, while sodium butyrate and Wnt-3a were dispensable and IDE1 was inefficient for this purpose. Second, we applied the protocol for generating DE cells in 2D culture to the differentiation of hiPSCs into DE in 3D. We investigated the influence of the formed spheroid size and the presence of scaffold on spheroid morphological characteristics as well as the success of DE formation. We demonstrated a reverse correlation between spheroid size and the efficacy of DE formation. A scaffold-based 3D environment can be beneficial for spheroid culture. However, it can negatively affect cell aggregation if the scaffold material possesses strong cell affinity. Moreover, the hydrogel-based scaffold can also impede mass transport and therefore slow down cell differentiation. Third, we investigated the effect of the thyroid hormone triiodothyronine (T3) in the hepatic differentiation of hiPSCs-derived hepatic cells. We found that T3 increased the expression of thyroid hormone responsive protein THRSP (or SPOT14) and decreased the expression of alpha-1-fetoprotein (AFP). To further investigate the role of AFP in thyroid hormone - mediated hepatic differentiation, we developed an effective protocol based on CRISPR/Cas9-mediated genome editing to create an AFP knockout (AFP-KO) cell line. The improved genome editing approach includes a staggered transfection and the use of a Cas-9-linked selection marker. By comparing wild type and AFP-KO cell lines, we found that AFP does not determine the action of T3 in hepatocyte differentiation. This study suggests an effective method for hPSCs differentiation into definitive endoderm cells which is necessary for further liver cell formation. It demonstrates the importance of the culture environment and control of spheroid size for spheroid formation and hiPSCs differentiation in 3D culture conditions. It shows that the thyroid hormone affects the expression of particular fetal and liver maturation genes, thereby participating in hepatic differentiation of hiPSCs. Furthermore, finally, this study suggests an improved methodology for RNA-based CRISPR-Cas9-mediated genome editing in hPSCs for the study of gene functions during the differentiation of hPSCs in vitro. Taken together, these findings are important for the further development of hPSC-derived liver cell models.Terapeuttisten yhdisteiden hepatotoksisuuden tutkiminen in vitro ennen kliinisiä tutkimuksia edellyttää luotettavaa ihmisen maksasolumallia. Primaaristen solulinjojen, hepatosellulaaristen karsinoomasolulinjojen ja eläinmallien puutteiden vuoksi kantasoluista johdetut maksamallit ovat lupaava työkalu lääkkeiden testaamiseen. Olemassa olevilla kantasoluista peräisin olevilla maksamalleilla on vajavaisuuksia, jotka edellyttävät maksan erilaistumismenetelmiä koskevia lisätutkimuksia ja parannuksia. Hepatosyytit, maksan runsain solupopulaatio, ovat vastuussa lääkkeiden metaboliasta. Tämä ominaisuus tekee niistä halutuimman maksasolutyypin lääkkeiden testaamiseen. Pluripotentit kantasolut (PSC) erilaistuvat hepatosyyteiksi muutamassa vaiheessa, definitiivisestä endodermistä (DE), maksan esisolujen (hepatoblastit) ja alkion hepatosyyttien kautta ja kypsiksi hepatosyyteiksi. Jokaista vaihetta kontrolloivat tietyt ulkoiset biokemialliset signaalit ja ympäröivään solunulkoiseen matriisiin (ECM) liittyvät fyysiset ympäristötekijät. Maksan onnistunut erilaistuminen in vitro riippuu valittujen olosuhteiden kyvystä jäljitellä maksan luonnollista kehitystä. Oikean lähestymistavan tulisi keskittyä solun erilaistustilan arviointiin erilaistamisen jokaisessa välivaiheessa. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli kehittää tehokas menetelmä ihmisen PSC:n erilaistumiseen toiminnallisiksi hepatosyyttien kaltaisiksi soluiksi (HLC) kaksiulotteisissa (2D) ja kolmiulotteisissa (3D) ympäristöissä spatiaalisesti ja ajallisesti ohjattujen fyysisten ja biokemiallisten vihjeiden avulla. Ensin työssä vertailtiin kuuden aiemmin käytetyn molekyylin tehokkuutta PSC:n erilaistamisessa DE:ksi. Suoritimme erilaistumisen ihmisen indusoiduille PSC:lle (hiPSC) ja ihmisen alkion kantasoluille (hESC). Arvioimme erilaistumisen dynaamista tehokkuutta käyttämällä erilaisia kasvutekijöiden (aktiviini A ja Wnt-3a) yhdistelmiä ja/tai pieniä molekyylejä (natriumbutyraattisuola ja IDE1). Osoitimme aktiviini A:n olevan tehokas ja riittävä lähtöaine DE-induktioon, kun taas natriumbutyraatti ja Wnt-3a olivat tarpeettomia ja IDE1 oli tehoton tähän tarkoitukseen. Toiseksi hyödynsimme 2D-viljelmän protokollaa hiPSC:n erilaistumiseen DE-soluiksi 3D:ssä. Tutkimme muodostuneen solusferoidin koon ja käytetyn matriksin vaikutusta sferoidin morfologisiin ominaisuuksiin sekä DE-erilaistuksen tehokkuuteen. Osoitimme negatiivisen korrelaation pallomaisen koon ja DE-muodostuksen tehokkuuden välillä. Viljelymatriksiin perustuva 3D-ympäristö voi olla hyödyllinen sferoidiviljelmälle. Se voi kuitenkin vaikuttaa myös negatiivisesti solujen aggregaatioon, jos materiaalilla on vahva soluaffiniteetti. Lisäksi hydrogeelipohjainen alusta voi estää massansiirtoa ja siten hidastaa solujen erilaistumista. Kolmanneksi tutkimme kilpirauhashormonin trijodityroniinin (T3) vaikutusta hiPSC:stä peräisin olevien epäkypsien maksasolujen maksaerilaistukseen. Havaitsimme, että T3 lisäsi kilpirauhashormoniin reagoivan THRSP (tai SPOT14) -proteiinin ilmentymistä ja vähensi alfa-1-fetoproteiinin (AFP) ilmentymistä. Tutkiaksemme tarkemmin AFP:n roolia kilpirauhashormonivälitteisessä maksan erilaistumisessa kehitimme tehokkaan protokollan, joka perustuu CRISPR/Cas9-välitteiseen genomieditointiin AFP-geeninpoisto (AFP-KO) -solulinjan luomiseksi. Tämä parannettu genomin muokkausmenetelmä sisältää vaiheittaisen transfektion ja Cas-9-linkitetyn valintamarkkerin käytön. Vertaamalla villityyppi- ja AFP-KO-solulinjoja havaitsimme, että AFP ei määritä T3:n toimintaa hepatosyyttien erilaistumisessa. Tämä tutkimus tuotti tietoa tehokkaasta menetelmästä hPSC:n erilaistumiseen lopullisiksi endodermisoluiksi, mikä on välttämätöntä maksasolujen muodostumisen jatkamiseksi. Tutkimus osoittaa kasvatusympäristön ja sferoidikoon hallinnan tärkeyden sferoidien muodostumisen ja hiPSC:n erilaistumisen kannalta 3D-viljelyolosuhteissa. Tutkimus osoittaa myös, että kilpirauhashormoni vaikuttaa tiettyjen sikiön ja maksan kypsymisgeenien ilmentymiseen ja osallistuu siten hiPSC:n maksan erilaistumiseen. Lopuksi tämä tutkimus tuotti tietoa parannellusta menetelmästä RNA-pohjaiseen CRISPR-Cas9-välitteiseen hPSC:n genomieditointiin geenitoimintojen tutkimiseksi hPSC:n erilaistumisen aikana in vitro. Yhdessä nämä havainnot ovat tärkeitä hPSC:stä johdettujen maksasolumallien jatkokehitykselle.
Subject: pharmaceutical Biosciences
Rights: Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
bogacheva_mariia_dissertation_2021.pdf 1.161Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record