The ER stress regulator Manf promotes hearing function by supporting the integrity of the stereocilia bundle of hair cells

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202110263920
Title: The ER stress regulator Manf promotes hearing function by supporting the integrity of the stereocilia bundle of hair cells
Author: Iivanainen, Vilma
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2021
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202110263920
http://hdl.handle.net/10138/335690
Thesis level: master's thesis
Degree program: Neurotieteen maisteriohjelma
Master's Programme in Neuroscience
Magisterprogrammet i neurovetenskap
Specialisation: Neurotiede
Neuroscience
Neurovetenskap
Abstract: Viimeaikaiset tutkimukset ovat yhdistäneet solulimakalvoston stressin perinnöllisen kuulovian, melukuulovaurion sekä ikähuonokuulon syntyyn. Nykyinen tutkimus on kuitenkin keskittynyt simpukan (kuuloelimen) aistinsolujen kuoleman tutkimiseen eikä solulimakalvoston stressin aiheuttaman kuulovaurion molekulaarisia mekanismeja tunneta hyvin. Käytimme C57BL/6J (B6) hiirikannan Manfflox/flox;Pax2-Cre poistogeenisiä (cKO) hiiriä tutkiaksemme geneettisesti aiheutetun pitkäaikaisen solulimakalvoston stressin vaikutusta kuulovaurion syntyyn. Näillä hiirillä keskiaivojen astrosyyttiperäistä neurotrofista tekijää (Manf) koodaava geeni on poistettu kudosspesifisesti simpukasta. Manfin on ehdotettu toimivan solulimakalvoston homeostasian säätelyssä ja sillä on havaittu olevan sytoprotektiivisia ominaisuuksia erilaisissa tautimalleissa sekä in vitro että in vivo. Manfin toimintamekanismia ei kuitenkaan vielä täysin tunneta ja vielä vähemmän ymmärretään sen toiminnasta sisäkorvassa. Aiemmissa tutkimuksissa cKO hiirillä on havaittu solulimakalvoston stressin lisääntyneen sisäkorvan aistinsoluissa. Nämä hiiret kärsivät kuulonalenemasta, jolle on tyypillistä ulkokarvasolujen kuolema korkeiden äänentaajuuksien alueella. cKO hiirien kuulokynnykset ovat kuitenkin muuttuneet jo 22:tena synnytyksen jälkeisenä päivänä (P22), jolloin ulkokarvasolujen kuolemaa ei vielä ole. Lisäksi aikuisten cKO hiirten kuulokynnykset ovat nousseet myös keski- ja matalataajuuksilla, joissa ulkokarvasolujen kuolemaa ei esiinny. Näin ollen kuulokynnysten nousun taustalla on oltava jokin toinen mekanismi aistinsolukuoleman lisäksi. Siksi halusimme tutkia solulimakalvoston stressin vaikutusta ulkokarvasolujen karvakimppuun. Karvakimppu koostuu karvasolun apikaalipinnan cilioista, joita kutsutaan stereocilioiksi. Niiden taipuminen vasteena ääniärsykkeeseen saa aikaan karvasolujen depolarisaation ja mahdollistaa ääniärsykkeen muuttamisen sähköiseksi signaaliksi. Karvakimppu onkin välttämätön rakenne kuulon toiminnalle. Tutkimme Manf cKO hiirten ulkokarvasolujen karvakimpun rakennetta pyyhkäisyelektronimikroskoopin (SEM) ja fluoresenssimikroskoopin avulla. Ulkokarvasolujen karvakimppujen stereociliat olivat epäjärjestyksessä jo P22 cKO hiirillä ja tämä epäjärjestys eteni hiirien vanhetessa stereocilioiden yhteensulautumiseksi. P56 cKO hiirillä stereociliat olivat sulautuneet yhteen kaikissa korkeiden äänentaajuuksien ulkokarvasolujen karvakimpuissa. Jatkoimme tutkimalla stereocilioiden tyviosan proteiineja, jotka kiinnittävät stereocilioiden solukalvon niiden aktiinitukirankaan ylläpitäen yksittäisten stereocilioiden rakennetta. Aiemmissa tutkimuksissa stereocilioiden tyviosan proteiinien mutaatiot on yhdistetty stereocilioiden yhteensulautumiseen ja karvakimpun epäjärjestykseen. Simpukan immunohistokemiallisista värjäyksistä havaitsimme, että stereocilioiden tyviproteiinit radiksiini (RDX) ja myosiini 6 (Myo6) ilmentyivät epänormaalisti korkeiden äänentaajuuksien alueilla, siten että ilmentyminen nousi stereocilioiden tyvestä apikaaliosaa kohti. Mielenkiintoisinta oli, että proteiinityrosiinifosfataasireseptori tyyppi Q (PTPRQ), joka ei normaalisti ilmenny aikuisissa ulkokarvasoluissa, ilmentyi cKO hiirien stereocilioissa RDX:in ja Myo6:den ilmentymiskaavaa vastaavalla tavalla. F-aktiiniin sitoutuvaa falloidiiniä hyödynsimme ulkokarvasolujen karvakimpun rakenneteen tarkastelun lisäksi myös näiden solujen kutikulaarilevyn tutkimiseen. Kutikulaarilevy on karvasolujen F-aktiiniverkosta koostuva rakenne, johon stereociliat kiinnittyvät. Aiemmat tutkimukset ovat havainneet kutikulaarilevyn häiriöiden olevan yhteydessä kuulovaurioihin ja rakenteeltaan epänormaaleihin stereocilioihin. Käytimme kvantitatiivista analyysia vertailemaan cKO ja WT hiirien kutikulaarilevyjen falloidiinivärjäyksien voimakkuutta ja löysimme P56 cKO hiirillä huomattavan F-aktiiniverkon tiheyden heikentymisen korkeiden äänentaajuuksien ulkokarvasolujen kutikulaarilevyissä. Tutkimuksemme perusteella voidaankin todeta Manfin puutteen aiheuttavan useita rakenteellisia poikkeamia ulkokarvasolujen karvakimpussa. Yhteenvetona voidaan todeta tutkimuksemme tuoneen uutta tietoa solulimakalvoston stressin monimuotoisuudesta kuulovaurion synnyssä. Havaitsimme, että aistinsolujen kuoleman lisäksi solulimakalvoston stressi voi johtaa rakenteellisiin muutoksiin ulkokarvasolujen karvakimpussa sekä kutikulaarilevyssä, aiheuttaen näin kuulovaurion. Tulevaisuudessa vaaditaan kuitenkin lisää tutkimusta, jotta Manfin toimintamekanismi sisäkorvassa saadaan selvitettyä. Manfin puutoksen vaikutusta tulisikin tutkia eri ikäisillä cKO hiirillä sekä muilla hiirikannoilla ja solulimakalvoston stressiä mallintavilla hiirillä.Recent studies have associated ER stress with various types of hearing loss, such as drug- and noise-induced, age-related, and hereditary hearing loss. However, the research has mostly focused on auditory sensory cell (hair cell) death, and it is not well understood if other molecular mechanisms can drive ER stress-dependent hearing loss. We used Manfflox/flox;Pax2-Cre conditional knockout (cKO) mice under the C57BL/6J (B6) mouse strain to study the effects of genetically-induced chronic ER stress on hearing function. In these mice, the gene coding for mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (Manf) has been silenced specifically in the cochlea. Manf is thought to act as an ER homeostasis regulator, and it has shown cytoprotective properties in different disease models both in vitro and in vivo. However, Manf’s mode of action is still poorly understood and even less is known about its function in the inner ear. Previously, cKO mice were found to upregulate ER stress markers in the cochlear hair cells. These mice develop progressive high-frequency hearing loss characterized by high-frequency outer hair cell (OHC) death. However, they have elevated hearing thresholds already at postnatal day 22 (P22) before any OHC death takes place and have elevated hearing thresholds in hearing frequencies where OHCs are retained. Therefore, there has to be another pathological mechanism besides OHC death accounting for the elevations in their hearing thresholds. Hence, we wanted to study the effect of ER stress on the outer hair cell hair bundle structure. The hair bundle is located at the apical pole of the hair cells, and it consists of filamentous actin (F-actin)-filled stereocilia. In mechanotransduction (MET), sound stimuli-induced motions of cochlear fluids cause stereocilia to deflect towards the tallest stereocilia row, allowing for depolarization of hair cells and transformation of mechanical force into electrical signal. Therefore, hair bundle is an essential structure for the hearing function. We used scanning electron microscopy (SEM) and fluorescent microscopy to study OHC hair bundles of cKO mice. We saw disorganization of the bundle structure already at P22. It progressed with age and advanced to strong stereocilia fusion by P56. At this age, all of the high-frequency OHCs of cKO mice displayed stereocilia fusion. We used cochlear whole mounts and immunostainings to study the protein composition of OHC stereocilia of Manf-deficient mice. The base of the stereocilia, termed as the tapering region, contains proteins that link the plasma membrane of stereocilia to their F-actin core, ensuring the cohesion of individual stereocilia. Mutations in these proteins have been associated with stereocilia fusion and hair bundle disorganization. At P56, we saw that stereocilia tapering region proteins radixin (RDX) and myosin 6 (Myo6) were mislocalized from the tapering region towards the apical tips of stereocilia in the high-frequency OHCs of cKO mice. Additionally, we saw that PTPRQ – a tapering region protein that is under normal conditions expressed only in the IHCs of mature cochlea – was upregulated in OHCs of cKO mice, yielding an expression pattern similar to RDX and Myo6. In addition, we used the F-actin probe phalloidin to quantitatively compare F-actin densities in the cuticular plates of cKO and WT mice. Cuticular plate is a structure responsible for attaching stereocilia to hair cell body. It consists of a dense F-actin network and prior studies have associated defects in the cuticular plate composition with hearing loss and stereocilia bundle abnormalities. We found a significant decrease in phalloidin staining intensity in the cuticular plates of high-frequency OHCs of cKO mice, indicating that their cuticular plate F-actin rigidity had been reduced. Together our data shows that Manf deficiency promotes diverse impairments in the OHC hair bundles, consequently inducing hearing loss. To conclude, our study presents novel insights into the complexity of ER stress-induced cochlear pathology. We show that ER stress impairs MET by inducing structural changes in the OHC hair bundle. It appears to be the major reason for hearing loss in the cKO mice, rather than hair cell death. In the future, the impact of Manf deficiency to the inner ear should be further studied. For example, younger and aged cKO mice could be studied to better characterize the progression of Manf deficiency-induced cochlear pathology and hearing loss. Similarly, Manf’s effect on hearing should be studied in other ER stress models to determine its role in the hearing function.
Subject: Cochlea
hearing loss
endoplasmic reticulum stress (ER stress)
mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (Manf)
stereocilia
hair bundle
cuticular plate
Protein Tyrosine Phosphatase Receptor Type Q (PTPRQ)
myosin 6
radixin
cadherin 23 (Cdh23)


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record