Yliopiston etusivulle Suomeksi På svenska In English Helsingin yliopisto

Automatable microplate-based in vitro assays for screening intestinal drug transport and metabolism

Show full item record

Files in this item

Files Description Size Format View/Open
automata.pdf 1.294Mb PDF View/Open
Use this URL to link or cite this item: http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-10-8061-6
Vie RefWorksiin
Title: Automatable microplate-based in vitro assays for screening intestinal drug transport and metabolism
Author: Soikkeli, Anne
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Pharmacy, Division of Pharmaceutical Technology
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Automation compatibility is a prerequisite for in vitro transport and metabolism assays that are designed for screening large numbers of compounds at the early stages of drug discovery, in parallel with activity optimization. However, automation of more complex assays has also many benefits, even if it does not always increase the throughput of the assay directly.

In this thesis work, a new automatable high throughput screening assay was developed for detecting different compound interactions with UGT1A6, one of the human intestinal UGT enzymes. The fluorescence-based assay relies on a robust probe reaction, glucuronidation of 1 naphthol by recombinant human UGT1A6, which yields a highly fluorescent product, 1 naphthylglucuronide. Under the optimized assay conditions, the plate reader-based analysis method was able to detect a given compound interaction with the enzyme, through the probe reaction, in a comparable manner to the (cumbersome) reference HPLC-based method. The new method can analyze the interaction of many different compounds with the UGT1A6 simultaneously.

The developed assay was then used to collect data for computational model development. The effects of different compounds on the probe glucuronidation rate were used for a classification model, based on an SVM method, and for 3D-QSAR models, based on CoMFA and CoMSIA analyses. Both the models indicated physicochemical parameters and functional groups that are important for the interaction of different compounds with the UGT1A6.

Interactions of two drugs, diclofenac and indomethacin, were studied more thoroughly with the several UGT enzymes, including UGT1A6. The effect of pH on the interaction was examined in both human liver and intestinal microsomes, as well as with many individual recombinant human UGTs. The results indicated that the effects of pH were both enzyme and substrate dependent, suggesting that changes in the enzyme, probably protonation of one or more amino acid side chain, played a major role in the observed effects.

Finally, automation of three different types of cell-based assays, Caspase-Glo® 3/7, sulforhodamine B and bidirectional Caco-2 monolayer transport assays, are described in detail. Although, the bidirectional Caco-2 assay was the most challenging for automation, due to the complex assay protocol and the sensitivity of the monolayer to mechanical stress, mainly caused by pipetting, automation improved the utilization potential of the laborious method significantly.Perinteisesti lääkekehityksen alkuvaiheessa on keskitytty muokkaamaan lääkeainekandidaatin molekyylirakennetta sellaiseksi, että sen biologinen aktiivisuus olisi mahdollisimman suuri. Tämän lähestymistavan on kuitenkin havaittu tuottavan paljon sellaisia aktiivisia molekyylejä, joiden farmakokineettiset ominaisuudet, kuten imeytyminen ja metabolia, saattavat olla ongelmallisia. Siksi nykyisin pyritään yhä tarkemmin testaamaan myös imeytymiseen ja metaboliaan vaikuttavia tekijöitä jo mahdollisimman aikaisessa vaiheessa.

Lääkeaineiden imeytyminen ohutsuolen seinämän läpi on monimutkainen prosessi, johon monet kuljetinproteiinit ja metaboliaentsyymit vaikuttavat. Jotta näitä prosesseja voitaisiin ennustaa mahdollisimman luotettavasti, tarvitaan sekä yksinkertaistettuja menetelmiä, joilla voidaan helposti ja nopeasti tutkia lääkkeen imeytymiseen ja metaboliaan vaikuttavia yksittäisiä osatekijöitä, että monimutkaisempia menetelmiä, joilla saadaan laajempaa tietoa näiden osatekijöiden yhteisvaikutuksesta.

Tässä väitöskirjatyössä keskityttiin automatisoitaviin testeihin, joilla tuotettua tietoa voidaan hyödyntää ennustettaessa kuljetinproteiinien ja metaboliaentsyymien vaikutusta yhdisteiden imeytymiseen ohutsuolen seinämän läpi. Työssä kehitettiin uusi helppo ja nopea kuoppalevypohjainen testi, jolla saadaan alustavaa tietoa siitä, voiko metaboliaentsyymi UGT1A6 hajottaa yhdisteen tai häiritä muiden saman entsyymin kautta metaboloituvien yhdisteiden hajoamista jo lääkeaineen imeytymisvaiheessa. Kehitettyä menetelmää hyödyntäen löydettiin bioaktiivisten molekyylien rakenneosia, jotka ovat ominaisia yhdisteille, joiden hajoamisessa UGT1A6-entsyymi on osallisena tai jotka saattavat häiritä muiden lääkeaineiden UGT1A6-entsyymivälitteistä hajoamista. Myös testiolosuhteilla, kuten reaktioseoksen happamuudella, havaittiin olevan vaikutusta testistä saataviin tuloksiin.

Työssä tarkasteltiin myös kolmen erityyppisen solupohjaisen testin (Caspase-Glo® 3/7 -testi, sulforodamiini B -testi ja Caco-2 permeaatiokoe) automatisoitavuutta, ja tuotiin esiin kunkin menetelmän kriittiset kohdat, jotka vaativat erityishuomiota testejä automatisoitaessa.

Yleisenä johtopäätöksenä voidaan todeta, että mitä yksinkertaisempaa solu-/entsyymipohjaista testiä pystytään käyttämään, sitä paremmin se soveltuu automatisoitavaksi ja sitä aikaisemmassa vaiheessa ja suuremmalle yhdistemäärälle testiä voidaan käyttää.
URI: URN:ISBN:978-952-10-8061-6
http://hdl.handle.net/10138/33636
Date: 2012-06-15
Copyright information: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
This item appears in the following Collection(s)

Show full item record

Search Helda


Advanced Search

Browse

My Account