Polyketide Reductases in Gerbera hybrida

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-8107-7
Title: Polyketide Reductases in Gerbera hybrida
Author: Zhu, Lingping
Contributor organization: University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Agricultural Sciences
Doctoral Program in Plant Sciences
Helsingin yliopisto, maatalous-metsätieteellinen tiedekunta
Kasvitieteen tohtoriohjelma
Helsingfors universitet, agrikultur-forstvetenskapliga fakulteten
Doktorandprogrammet i botanik
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2022-05-06
Language: eng
Belongs to series: URN:ISSN:2342-5431
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-8107-7
http://hdl.handle.net/10138/342707
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: The vast ranges of chemically diverse plant polyketides are well-known for their important functions in plants and to human health. Plant polyketides consist of the most widely distributed pollen wall structural element sporopollenin, the ubiquitous and chemically diverse flavonoids, and various taxa-specific natural products. Despite the vast diversity, plant polyketides are synthesized in a common logic. Type III polyketide synthases (PKSs) synthesize the backbones and post-PKS tailoring enzymes provide accurate modifications to determine the final chemical diversity. Compared with plant PKSs that have been intensively investigated, the important tailoring enzymes are largely unknown. The ornamental plant Gerbera hybrida is rich in two defense-related polyketides gerberin and parasorboside, in addition to sporopollenin and flavonoids. Gerberin/parasorboside biosynthesis has been shown to be initiated by gerbera 2-pyrone synthase 1 (G2PS1), while the accessory polyketide reductases (PKRs) have been missing. In this thesis, by coexpression analysis, we identified two PKR candidates in this pathway, gerbera reductase1 (GRED1) and GRED2. They were shown to be the second PKR required for parasorboside biosynthesis by expression and metabolite analysis of different gerbera tissues, cultivars, and transgenic gerbera plants and in vitro enzyme assays. We also showed that PKRs act on the linear triketide intermediate prior to its lactonization in gerberin/parasorboside biosynthesis. This updated pathway indicates that plant polyketide biosynthesis shares tailoring strategies with fungi and bacteria. Sporopollenin has been uncovered to be synthesized through a conserved anther-specific PKS pathway. We showed that GRED1 and GRED2 are orthologues of Arabidopsis tetraketide α-reductase 2 (AtTKPR2), a minor PKR involved in sporopollenin biosynthesis. Their important role in parasorboside biosynthesis indicates that the duplicate gerbera TKPR2s have been recruited from the ancient sporopollenin biosynthesis to a defense-related PKS pathway. The functional diversification of gerbera TKPR2s is an example of how plants get metabolic innovation for adaption during evolution. We showed that GRED1 and GRED2 still sustained the minor role in pollen wall formation. Moreover, we identified and characterized GTKPR1, the gerbera orthologue of AtTKPR1, the predominant PKR in sporopollenin biosynthesis. GTKPR1 was shown to play a conserved predominant role in pollen wall formation. Cultivar-specific pigmentation of gerbera has been shown to be a result of substrate preferences of dihydroflavonol 4-reductases (DFRs). Substrate specificity of DFRs from different species have been investigated for decades. However, which amino acids are responsible for it remains unknown. Two major technical challenges hindering the investigation are: difficult to make heterologous DFRs and lack of a reliable assay for the determination of substrate preferences. In this thesis, we established a highly efficient DFR expression system in tobacco and refined the traditional BuOH-HCl assay into a reliable and robust assay for the determination of DFR substrate preferences.Kemiallisesti monipuolisilla kasvien polyketideillä on tärkeitä tehtäviä kasveissa ja usein positiivisia vaikutuksia ihmisten terveyteen. Kasvipolyketidit koostuvat laajimmin levinneestä siitepölyn seinämän rakenne-elementistä sporopolleniinista, yleisistä ja kemiallisesti monimuotoisista flavonoideista sekä erilaisista taksonikohtaisista luonnonaineista. Valtavasta monimuotoisuudesta huolimatta kasvipolyketidit syntetisoidaan yhteisellä logiikalla. Tyypin III polyketidisyntaasit (PKS:t) syntetisoivat molekyylien rungot, joita räätälöintientsyymit muokkaavat määrittäen lopullisen kemiallisen rakenteen. Verrattuna intensiivisesti tutkittuihin kasvien PKS:iin, räätälöintientsyymit ovat suurelta osin tuntemattomia. Koristekasvi gerbera (Gerbera hybrida) sisältää runsaasti sporopolleniinin ja flavonoidien lisäksi kahta puolustukseen liittyvää polyketidiä gerberiiniä ja parasorbosidia. Gerberiinin/parasorbosidin biosynteesin on osoitettu käynnistyvän gerberan 2-pyronisyntaasi 1:n (G2PS1) toimesta, mutta tarvittavat polyketidireduktaasit (PKR:t) ovat olleet tuntemattomia. Tässä opinnäytetyössä tunnistettiin ekspression perusteella kaksi PKR-ehdokasta tälle reitille, gerbera reduktaasi1 (GRED1) ja GRED2. Niiden osoitettiin katalysoivan toista, parasorbosidibiosynteesiin vaadittava pelkistysreaktiota erilaisten gerberasolukkojen, -lajikkeiden ja siirtogeenisten gerberakasvien ilmentymis- ja metaboliittianalyysin perusteella sekä in vitro entsyymimäärityksillä. Osoitimme myös, että PKR:t muokkaavat lineaarista triketidivälituottetta ennen sen laktonisaatiota gerberiinin/parasorbosidin biosynteesissä. Päivitetty reitti osoittaa, että kasvien polyketidibiosynteesillä on yhteisiä räätälöintistrategioita sienten ja bakteerien biosynteesireittien kanssa. Sporopolleniini muodostuu konservoituneen ponnespesifisen PKS-reitin kautta. Osoitimme, että GRED1 ja GRED2 ovat ortologeja lituruohon tetraketidi-α-reduktaasi 2:lle (AtTKPR2), jolla on vähäinen rooli sporopolleniinin biosynteesissä. Entsyymin merkittävä rooli parasorbosidin biosynteesissä osoittaa, että gerberan TKPR2:n rooli on laajentunut muinaisesta sporopolleniinin biosynteesistä puolustukseen liittyvään PKS-reittiin. Gerbera TKPR2:n toiminnallinen monipuolistuminen on esimerkki siitä, kuinka kasvit kehittävät aineenvaihdunnan innovaatioita evoluution aikana. Osoitimme myös, että GRED1 ja GRED2 ovat säilyttäneet vähäisen roolinsa siitepölyn seinämän muodostumisessa. Lisäksi tunnistimme ja karakterisoimme GTKPR1:n, AtTKPR1:n gerbera-ortologin, hallitsevan PKR:n sporopolleniinin biosynteesissä. GTKPR1:llä osoitettiin olevan konservoitunut hallitseva rooli siitepölyn seinämän muodostumisessa. Gerberan eri lajikkeille ominaisen pigmentaation on osoitettu olevan seurausta dihydroflavonoli-4-reduktaasien (DFR) substraattipreferenssistä. Eri lajien DFR-entsyymien substraattispesifisyyttä on tutkittu vuosikymmeniä. Kuitenkin on edelleen avoin kysymys, mitkä aminohapot ovat vastuussa tästä. Kaksi tutkimusta hankaloittavaa teknistä haastetta ovat vaikeus tuottaa entsyymiä tutkimusta varten ja luotettavan määritysmenetelmän puuttuminen. Tässä opinnäytetyössä kehitimme erittäin tehokkaan DFR-ilmentämismenetelmän tupakassa ja hioimme perinteisen BuOH-HCl-määrityksen luotettavaksi työkaluksi DFR-substraattien preferenssien määrittämiseksi.
Subject: biotechnology
Rights: Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
zhu_lingping_dissertation_2022.pdf 1.504Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record