Title: | BIOPHOTONICS IN BIOPHARMACEUTICAL APPLICATIONS |
Author: | Zini, Jacopo |
Contributor organization: | University of Helsinki, Faculty of Pharmacy, Division of Pharmaceutical Biosciences and Drug Research Program, Doctoral Programme in Materials Research and Nanoscience Helsingin yliopisto, farmasian tiedekunta Materiaalitutkimuksen ja nanotieteiden tohtoriohjelma Helsingfors universitet, farmaceutiska fakulteten Doktorandprogrammet i materialforskning och nanovetenskap |
Publisher: | Helsingin yliopisto |
Date: | 2022-06-10 |
Language: | eng |
URI: |
http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-8213-5
http://hdl.handle.net/10138/343988 |
Thesis level: | Doctoral dissertation (article-based) |
Abstract: | Biopharmaceutical products are composed of complex or ordinate combinations of proteins, lipids, sugars, and nucleic acids or living cells or tissues. Due to the intrinsic variability of biological systems and the complexity of the bioprocesses involved in the production of these products, new technologies are required to monitor and characterize, the production processes and the final products. Biophotonic techniques, particularly Raman and Infrared (IR) spectroscopy are rapid, robust, operator independent, non-destructive and label free, thus particularly suitable for these purposes. This dissertation first investigates the use of biophotonic techniques in research of Extracellular Vesicles (EVs). EVs act as intercellular messengers and therefore have considerable potential in drug delivery system, diagnostic biomarker, or therapeutic agent. Subsequently highlighting the need and potential of a new kind of time gated Raman spectrometer to be created.
Raman and IR spectroscopy are methods able to characterize and assess the quality of EV suspensions with different degree of purity. These vibrational spectroscopic techniques show different intrinsic advantages, as they are label free and operator independent methods. Particularly, Raman might be the most suitable technology since it is less sensitive to water compared to IR. Raman spectroscopy reveals the information on the chemical composition and physical status of the analyte. However, it does not provide information of the analyte environment which the spectrofluorometer can gather. EVs studied by spectrofluorometer are required to be labelled with a fluorescent dye. Results obtained by fluorescence lifetime imaging spectroscopy underline that the cell uptake of the fluorescently labelled EVs is feasible. Attention must be paid to the efficacy of the labelling and further to the elimination of the unbound dye since the labelling may severely compromise the results or lead to wrong conclusions on EV functionality.
The combined advantage of Raman spectroscopy and fluorescence decay are obtained by a previously in-house developed time resolved Raman spectrometer. Thanks to the peculiar sensor of the spectrometer, the width of the time gate can be modified which is used to separate the Raman signal from the fluorescence tail. The modifications can be done even in the data post-processing phase, to obtain the best possible Raman signal-to-noise ratios. The simultaneously detected Raman spectra and time-resolved fluorescence decay curves are used to study the diffusion of small molecular drugs in a hydrogel. The data reveal the chemical composition, physical status, and the interaction with the environment of the samples. Taken together the obtained results suggest that the quality of EV suspensions can be assessed by Raman spectroscopy and their cell uptake detected by fluorescence lifetime spectroscopy. Both Raman spectra and fluorescence decay can be measured simultaneously by a second generation of time-resolved Raman spectrometer. Biofarmaseuttiset tuotteet koostuvat proteiinien, lipidien, sokereiden ja nukleiinihappojen tai elävien solujen tai kudosten järjestäytyneistä tai monimutkaisista yhdistelmistä. Biologisten järjestelmien luontaisen vaihtelevuuden ja näiden tuotteiden valmistukseen liittyvien bioprosessien monimutkaisuuden vuoksi tarvitaan uusia teknologioita tuotantoprosessien ja lopputuotteiden seurantaa ja karakterisointia varten. Biofotoniset tekniikat, erityisesti Raman- ja Infrapuna (IR) -spektroskopia ovat nopeita, luotettavia, hellävaraisia, leimattomia ja käyttäjästä riippumattomia tekniikoita, jotka soveltuvat erityisen hyvin biofarmaseuttisten tuotteiden määritykseen. Tämä väitöskirjan alussa tutkitaan biofotonisten tekniikoiden käyttöä solunulkoisten vesikkeleiden (EV:iden) tutkimuksessa. EV:t toimivat solujenvälisessä viestinnässä ja siksi niillä on huomattava potentiaali lääkekehityksessä, diagnostisina biomarkkerina ja terapeuttisina tekijöinä. Myöhemmin tutkimuksessa korostetaan uudenlaisen aikaerotteisen Raman-spektrometrin tarvetta ja mahdollisuuksia biofarmaseuttisten tuotteiden määrityksessä. Raman- ja IR-spektroskopia ovat menetelmiä, joilla voidaan karakterisoida ja arvioida eri puhtausasteen omaavia EV-näytteiden laatua. Nämä värähtelyspektroskooppiset tekniikat ovat leimattomia ja käyttäjästä riippumattomia menetelmiä. Verrattuna IR-spektroskopiaan, Raman on luonteeltaan mahdollisesti käyttökelpoisin tekniikka EV:iden karakterisointiin, sillä veden läsnäolo näytteessä ei häiritse mittausta. Raman-spektroskopian avulla saadaan tietoa analyytin kemiallisesta koostumuksesta sekä fysikaalisesta tilasta ja spektrofluorometrin avulla saadaan kerättyä informaatiota analyytin ympäristöstä, mihin Raman ei puolestaan pysty. Spektrofluorometrillä tutkitut EV:t on leimattava fluoresoivalla väriaineella ja fluoresenssin eliniän kuvantamisspektroskopialla saadut tulokset korostavat, että fluoresenssileimattujen EV:iden soluunotto on mahdollista. Leimauksen tehokkuuteen ja sitoutumattoman väriaineen eliminointiin on kiinnitettävä huomiota, sillä virheellinen leimaus voi väärentää tuloksia tai johtaa virheellisiin johtopäätöksiin EV:iden funktionaalisuudesta. Talon sisällä rakennetun laitteiston avulla on saatu yhdistettyä Raman-spektroskopia ja fluoresenssin eliniän vaimeneminen. Spektrometrin omalaatuisen anturin ansiosta kuvantamisen aikaikkunaa pystytään muokkaamaan, minkä avulla Raman-signaali pystytään erottamaan fluoresenssisignaalista. Muutokset voidaan tehdä myös datan jälkikäsittelyvaiheessa parhaan mahdollisen Raman-signaali-kohinasuhteen saamiseksi. Pienmolekyylisten lääkkeiden diffuusion tutkimiseen hydrogeelissä voidaan käyttää samanaikaisesti havaittuja Raman-spektrejä ja aikaerotteisia fluoresenssin vaimenemiskäyriä. Kerätty aineisto paljastaa näytteiden kemiallisen koostumuksen, fysikaalisen tilan ja vuorovaikutuksen ympäristön kanssa. Yhdessä saadut tulokset viittaavat siihen, että EV-suspensioiden laatua voidaan arvioida Raman-spektroskopialla ja niiden soluunotto havaita fluoresenssielinaikaspektroskopialla, kun Raman-spektri ja fluoresenssin heikkeneminen voidaan mitata samanaikaisesti toisen sukupolven aikaerotteisella Raman-spektrometrillä. |
Subject: | biopharmacy |
Rights: | Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty. |
Total number of downloads: Loading...
Files | Size | Format | View |
---|---|---|---|
zini_jacopo_dissertation_2022.pdf | 2.184Mb |
View/ |