Yliopiston etusivulle Suomeksi På svenska In English Helsingin yliopisto

Cellular signalling and activation of oocyte secreted human growth and differentiation factors BMP15 and GDF9

Show simple item record

dc.contributor Helsingin yliopisto, lääketieteellinen tiedekunta, kliinisteoreettinen laitos fi
dc.contributor Helsingfors universitet, medicinska fakulteten, Haartman institutet sv
dc.contributor University of Helsinki, Faculty of Medicine, Haartman Institute, Bakteriologian ja Immunologian osasto en
dc.contributor Biomedicum Helsinki, Programme for Developmental and Reproductive Biology en
dc.contributor.author Hankaniemi, Minna fi
dc.date.accessioned 2012-11-27T08:23:04Z
dc.date.available 2012-12-11 fi
dc.date.available 2012-11-27T08:23:04Z
dc.date.issued 2012-12-21 fi
dc.identifier.uri URN:ISBN:978-952-10-8526-0 fi
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10138/37637
dc.description.abstract Bone morphogenetic protein 15 (BMP15) and growth differentiation factor 9 (GDF9) are growth factors expressed by oocytes and are among the key regulators transmitting the signaling between the oocyte and the surrounding granulosa cells. Genetic studies have shown that these factors are essential regulators of normal fertility in mammals. BMP15 gene deficient mice exhibit a mild reduction in fertility, whereas sheep homozygous for a mutant form of BMP15 are sterile. In the case of GDF9, knockout mice and homozygous mutant sheep are also sterile the ovaries being non functional due to an early block in folliculogenesis. In humans, aberrant expression of these factors has been involved in premature ovarian failure (POF), polycystic ovary syndrome (PCOS) or dizygotic twinning. ----- This thesis was aimed to define the signaling and activation of human BMP15 (hBMP15) and GDF9 (hGDF9) proteins. The lack of bioactive hGDF9 had restricted the in vitro studies previously and the first aim of this thesis was to produce and purify bioactive hGDF9 protein. We found that hGDF9 is secreted in a latent form. Although mouse GDF9 (mGDF9) and hBMP15 are produced in active form their bioactivity is lost when a C-terminal affinity purification tag is added. We found also, that an N-terminal epitope tag does not have a deleterious effect on the bioactivity of mGDF9 or hBMP15 and they can be purified using immobilized metal affinity (IMAC) and high performance liquid chromatography approaches. A purified wild type hGDF9 (hGDF9wt) mature region became available to us during this thesis project and we found that it is a highly bioactive and stable protein activating the Smad3/4 signaling pathway. Subsequently we produced and purified a bioactive wild type hBMP15 (hBMP15wt) form, which was highly bioactive and activated the Smad1/5/8 signaling pathway in human granulosa luteal (hGL) cells. Physico-chemical characterization of BMP15 revealed that it consists of P16 and P17 forms, where P16 seems to be phosphorylated and P17 glycosylated. ------ It has been shown previously that a recombinant BMP type II receptor ectodomain Fc fusion protein (BMPR2ecd Fc) is able to inhibit the actions of BMP15 and GDF9 in vitro. For studying the effect of BMPR2ecd Fc on mouse folliculogenesis, we produced and purified this protein. These in vivo studies demonstrated that by administering the BMPR2ecd-Fc protein, we were able to dose-dependently modulate ovarian folliculogenesis in mice. -------- In order to determine the cell surface receptor binding components for human BMP15, we engineered and produced a covalent dimer of hBMP15 and labeled it radioactively. We found that it behaves biologically in a similar manner as the hBMP15wt. Human BMP15 strongly bound to BMPR1B and BMPR2 on the COV434 cell surface, an association which was further verified in COS-7 cells by overexpression of these receptors. In conclusion, we have for the first time produced and characterized recombinant human GDF9 and BMP15 protein in native form and thus developed valuable tools for studies aiming at understanding their role in human reproductive medicine. The production and purification methods developed during this thesis are widely applicable for the isolation and characterization of comparable oocyte growth factors in other species and thus have wide applicability in reproductive biology studies in the future. en
dc.description.abstract Munasolun ja sitä ympäröivän munarakkulasolukon normaali kehitys on tärkeää naisen hedelmällisyydelle. Luun morfogeneettinen proteiini-15 (BMP15) sekä kasvu- ja erilaistumistekijä-9 (GDF9) ovat munasolusta erittyviä kasvutekijöitä, jotka ovat olennaisia hedelmöityskykyisen munasolun aikaansaamisessa ja kypsymisessä. Luonnolliset mutaatiot ovat osoittaneet, että BMP15 on välttämätön mono-ovulatoristen nisäkkäiden, kuten lampaan ja ihmisen hedelmällisyydelle. Lampailla, joilla toinen BMP15 geenin kopio on mutatoitunut, esiintyy monilukuisia munasolujen irtoamisia sekä kaksois- ja kolmoisraskauksia, kun taas lampaat, joiden molemmat BMP15 geenin kopiot ovat mutatoituneet ovat steriilejä, koska munarakkulakehitys pysähtyy hyvin varhaiseen vaiheeseen. Munasarjojen monirakkulasyndrooma (polycystic ovary syndrome, PCOS) on yleisin syy naisten hedelmättömyyteen, ja epänormaalin GDF9:n ilmentymisen on osoitettu liittyvän PCOS:aan. Myös munasarjojen ennenaikaisesta toimintahäiriöstä kärsiviltä potilailta (premature ovarian failure, POF) on löydetty mutaatioita BMP15 ja GDF9 geeneistä. Tutkimukset ovat myös osoittaneet, että mutaatiot GDF9 geenissä ovat merkittävästi yleisempiä erimunaisten kaksosten äideillä kuin yksilapsisilla äideillä. --------- Ensimmäinen tavoite tässä tutkimuksessa oli bioaktiivisen ihmisen GDF9 proteiinin tuotto ja puhdistus. Tämän tavoitteen toteuduttua pystyimme karakterisoimaan ihmisen GDF9:n signalointia munasolua ympäröivissä granuloosasoluissa. Tuotimme ja eristimme myös ihmisen BMP15 proteiinia samalla kehittämällämme menetelmällä ja karakterisoimme sen signaalinvälitysreittejä kohdesoluissa ja proteiinin biokemiallisia ja biofysikaalisia ominaisuuksia. Tutkimustemme mukaan näiden proteiinien bioaktiivisuus on herkkä C-terminaaliselle modifikaatiolle, koska normaalisti hiiren GDF9 ja ihmisen BMP15 tuotetaan bioaktiivisessa muodossa, mutta bioaktiivisuus häviää C-terminaalisen modifikaation seurauksena. Tuotimme myös stabiloidun kovalenttisen dimeerimuodon ihmisen BMP15 proteiinista, jonka avulla osoitimme, että ihmisen BMP15 sitoutuu BMPR1B ja BMPR2 reseptoreihin COV434 granuloosasolujen pinnalla. Tutkimme myös follikulogeneesin (eli munarakkulakehityksen) säätelyä hiirimalleissa. Havaitsimme kokeissamme, että BMP15 ja GDF9 käyttämän solureseptorin (BMPRII) sitojaosan sisältävä estäjämolekyyli kykenee muuntelemaan munarakkulakehitystä eläinmallissa ----------- Tässä tutkimuksessa on löydetty hyödyllisiä menetelmiä ainutlaatuisten työkalujen kehittämiseksi lisääntymisbiologiseen tutkimukseen. Tämä tutkimus osoittaa mm., että ihmisen GDF9 indusoi TGF-β-tyyppisen solunsisäisen vasteen aktivoiden Smad2 ja -3 transkriptiofaktorit ja ihmisen BMP15 indusoi BMP-tyyppisen solunsisäisen vasteen aktivoiden Smad1, -5 ja -8 transkriptiofaktorit. Ihmisen BMP15 ja GDF9 käyttämien signaalinvälitysteiden, sekä solu- ja molekyylitason säätelymekanismien tunnistaminen luo perustan uusien lääketieteellisten sovellusten kehittämiselle hedelmöityshoitoihin. Tässä tutkimuksessa kehitetyt menetelmät ovat luoneet välttämättömän tietopohjan ja työkalut, jotta näiden kasvutekijöiden lääketieteellinen merkitys voidaan selvittää. Tulevaisuudessa tarvitaan lisää tutkimusta, jotta selviää voidaanko BMP15 ja GDF9 proteiineja hyödyntää potilaiden hoidossa ja voidaanko näitä kasvutekijöitä määrittämällä saada hyödyllistä uutta diagnostista tietoa potilaiden hoidon parantamiseksi. fi
dc.language.iso en fi
dc.rights Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty. fi
dc.rights This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited. en
dc.rights Publikationen är skyddad av upphovsrätten. Den får läsas och skrivas ut för personligt bruk. Användning i kommersiellt syfte är förbjuden. sv
dc.subject lääketiede fi
dc.title Cellular signalling and activation of oocyte secreted human growth and differentiation factors BMP15 and GDF9 en
dc.type.ontasot Väitöskirja (artikkeli) fi
dc.type.ontasot Doctoral dissertation (article-based) en
dc.type.ontasot Doktorsavhandling (sammanläggning) sv
dc.ths Mottershead, David fi
dc.ths Ritvos, Olli fi
dc.opn Vainio, Seppo fi
dc.type.dcmitype Text fi

Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record

Search Helda


Advanced Search

Browse

My Account