Assay optimization and screening for hepatitis C virus replication inhibitors from marine-derived substances

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151235
Title: Assay optimization and screening for hepatitis C virus replication inhibitors from marine-derived substances
Author: Jokinen, Nora
Other contributor: Helsingin yliopisto, Farmasian tiedekunta
University of Helsinki, Faculty of Pharmacy
Helsingfors universitet, Farmaceutiska fakulteten
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2013
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151235
http://hdl.handle.net/10138/40773
Thesis level: master's thesis
Discipline: Farmakognosi
Pharmacognosy
Farmakognosia
Abstract: Estimated 180 million people worldwide are infected by hepatitis C virus. It causes liver diseases which are often asymptomatic. Chronic infections can lead to liver cirrhosis, transplantation and hepatocellular carcinoma. Drug development was slow until 1999 when the first cell culture model with autonomously replicating subgenomic HCV replicon was developed. It expresses the viral proteins that are necessary in HCV replication. The current interest in exploring new medicines is concentrated to the essential viral proteins, such as the NS3/4A protease, NS3 helicase, NS5A and NS5B RNA polymerase. HCV belongs to the Hepacivirus genus. Due to its high variability there are at least seven genotypes and several subtypes. Genotype 1 is the most common and the most difficult to treat. The current standard of care continues 24-48 weeks and consists mainly of pegylated interferon alpha and nucleoside analogue ribavirin, both non-specific HCV medicines with severe adverse effects. In 2011 two new direct-acting antivirals, protease inhibitors telaprevir and boceprevir, were approved for the treatment of HCV. A vaccine against HCV has not yet been developed. The aim of this study was to optimize and validate a robust cell-based assay for screening of replication inhibitors against HCV. Genetically modified Huh-7 cells harbor a subgenomic HCV replicon expressing only the viral proteins needed in viral replication. In addition, the replicon encodes a firefly luciferase as a reporter gene. The amount of expressed luciferase is directly correlated with the amount of HCV replication making the replicon system suitable for HTS. The optimized and validated method was used for screening HCV replication inhibitors from a library containing 113 marine-derived substances. Marine environment has been in recent years a very interesting source for finding new drug candidates. This study was part of international MAREX project which aims to discover new active molecules from marine resources. A total of 37 samples (32.7%) exhibited antiviral activity over 50%. A cytotoxicity evaluation in ATP assay was performed with these samples. 10 samples (27.0%) exhibited cytotoxicity below 20%, of which six were synthetic samples and four were extracts. Compounds with high antiviral activity, low cytotoxicity and clear dose-response in further studies should be tested with a cell line expressing the full-length HCV genome. The structural proteins can exhibit some characteristics which inactivate the compound identified as active in the replicon system.Maailmassa on arviolta 180 miljoonaa hepatiitti C -viruksen kantajaa. C-hepatiitti aiheuttaa usein oireettomia maksasairauksia. Krooniset infektiot voivat aiheuttaa maksakirroosia, johtaa elinsiirtoon tai maksasyöpään. Lääkkeiden kehitys oli hidasta kunnes vuonna 1999 kehitettiin ensimmäinen soluissa itsenäisesti kopioituva virusmalli, joka ilmensi vain osaa koko viruksen genomista. Nykyinen lääkekehitystutkimus kohdistuu viruksen kopioitumisen kannalta tärkeisiin proteiineihin, kuten NS3/4A proteaasiin, NS3 helikaasiin, NS5A proteiiniin sekä NS5B RNA polymeraasiin. Hepatiitti C -virus kuuluu Hepasivirusten sukuun. Geneettisen vaihtelun takia tähän mennessä on tunnistettu ainakin seitsemän eri genotyyppiä ja useita alatyyppejä. Genotyyppi 1 on yleisin maailmassa, ja samalla kaikista vaikein hoitaa. Nykyinen hoito perustuu pääasiassa 24-48 viikkoa kestävään hoitoon pegyloidulla interferoni alfalla sekä nukleosidirakenteisella ribaviriinillä, joista kumpikaan ei ole erityisesti C-hepatiitin hoitoon suunniteltu lääke. Lisäksi tällä hoidolla on paljon vakavia haittavaikutuksia. Vuonna 2011 markkinoille tuli kaksi uutta suoraan C-hepatiittia vastaan kehitettyä lääkettä, proteaasin estäjät telapreviiri ja bosepreviiri. C-hepatiittia vastaan ei ole onnistuttu kehittämään vielä rokotetta. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli optimoida ja validoida toistettava solupohjainen seulontamenetelmä antiviraalisen aktiivisuuden määritystä varten. Geneettisesti muunnellut Huh-7 solut ilmentävät vain osaa hepatiitti C -viruksen genomista, ja ne tuottavat vain kopioitumiseen tarvittavia virusproteiineja. Lisäksi genomiin oli lisätty tulikärpäsestä peräisin oleva lusiferaasigeeni, jonka tuottamaa luminesenssia mittaamalla arvioitiin virusproteiinien tuottoa. Solujen tuottaman lusiferaasin määrä on suoraan verrannollinen hepatiitti C virusproteiinien kopioitumiseen. Optimoitua ja validoitua menetelmää käytettiin hepatiitti C -viruksen kopioitumista estävien aineiden seulontaan yhdistekirjastosta, joka sisälsi merieliöperäisiä näytteitä yhteensä 113. Meren mikro- ja makro-organismit ovat viime vuosina olleet kiinnostava lähde uusien lääkkeiden etsinnässä. Tämä tutkimus oli osa kansainvälistä MAREX-hanketta, joka tähtää uusien aktiivisten molekyylien löytämiseen. Yhteensä 37 yhdistettä (32,7 %) osoittivat yli 50 % antiviraalista tehoa. Näiden yhdisteiden sytotoksisuus tutkittiin ATP:tä mittaavalla kokeella. 10 yhdistettä (27,0 %) osoittivat alle 20 % sytotoksisuutta. Näistä kuusi oli synteettisiä yhdisteitä ja neljä uutteita. Yhdisteistä, jotka osoittivat hyvää antiviraalista tehoa sekä alhaista sytotoksisuutta, tulee tutkia jatkossa niiden annos-vastesuhde. Nämä yhdisteet tulisi myös tutkia solulinjalla, joka ilmentää koko hepatiitti C -viruksen genomia. Vaikka yhdiste on ollut aktiivinen soluissa, jotka ilmentävät vain osaa hepatiitti C -viruksen genomista, viruksen rakenneproteiinit voivat kuitenkin vaikuttaa yhdisteen tehoon ja inaktivoida sen.
Subject: Hepatitis C virus
replication inhibitor
antiviral screening
cell-based assay
luciferase reporter


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record