Ektomykorritsasienten proteaasintuotto ja proteaasiaktiivisuuksien vuodenaikaisvaihtelu metsämaassa

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201507212102
Title: Ektomykorritsasienten proteaasintuotto ja proteaasiaktiivisuuksien vuodenaikaisvaihtelu metsämaassa
Author: Bäcklund, Kirsi
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Food and Environmental Sciences
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2013
Language: fin
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201507212102
http://hdl.handle.net/10138/40838
Thesis level: master's thesis
Discipline: Mikrobiologi
Microbiology
Mikrobiologia
Abstract: Boreaalisessa metsämaassa on suuret typpivarannot. Suurin osa typestä on sitoutuneena humukseen ja proteiineihin kasveille vaikeasti hyödynnettävään muotoon. Kasveille helposti hyödynnettävien ammoniumin ja nitraatin sekä yksinkertaisten aminohappojen määrä metsämaassa on puolestaan hyvin pieni. Puut muodostavat ektomykorritsoja eli sienijuuria useiden sienilajien kanssa. Sieni saa hiiliyhdisteitä puulta ja puu saa ravinteita sieneltä. Jotkut ektomykorritsoja muodostavat sienet tuottavat proteaaseja eli proteiineja pilkkovia entsyymejä. Tämä symbioosi on mahdollisesti tärkeä maan proteiineihin sitoutuneiden typpivarantojen hyödyntämisessä ja puiden typensaannissa. Tutkimuksen päätavoitteena oli mitata, tuottavatko mykorritsat proteaaseja metsämaassa ja selvittää, vaihtelevatko mykorritsojen proteaasiaktiivisuudet eri vuodenaikoina. Lisäksi haluttiin selvittää, löytyykö maanesteestä proteaasiaktiivisuutta ja vastaavatko maanesteen ja mykorritsojen proteaasiaktiivisuudet toisiaan eri vuodenaikoina. Mykorritsoista oli tarkoitus eristää puhdasviljelmiä ja mitata niiden proteaasiaktiivisuuksia sekä selvittää puhdasviljelmien sienilajit. Taustatietona haluttiin selvittää mykorritsallisten ja mykorritsattomien juurenkärkien sekä kuolleiden ja katkenneiden juurenkärkien määrät sekä proteaasia tuottavien mykorritsamorfotyyppien määrät eri vuodenaikoina. Näytteet otettiin Keski-Suomessa sijaitsevalta Hyytiälän metsäasemalta maalis- ja lokakuun välisenä aikana. Joka kuukausi otettiin viisitoista maakairaa ja jokaisen maakairan humuskerroksesta pyrittiin poimimaan satunnaisesti kahdeksan männynjuurissa esiintyvää mykorritsaa. Mykorritsoista ja homogenoidun humuskerroksen maanesteestä mitattiin proteaasiaktiivisuudet Protease Fluorescent Detection Kit (PF0100-1KT, SIGMA, Yhdysvallat) -kitillä. Kitin detektiorajana oli entsyymiaktiivisuus, joka vastasi 5 ng:sta trypsiinikontrollia saatua aktiivisuutta. Tulokset luettiin trypsiinistandardisuoralta, joten näytteiden proteaasiaktiivisuudet vastaavat fluoresenssiltaan tiettyä trypsiinikontrollin määrää. Puhdasviljelmät eristettiin Hagem’s-agarmaljoille ja lajit selvitettiin monistamalla ja sekvensoimalla ITS-geenialuetta. Juurenkärkien ja morfotyyppien määrät laskettiin mikroskopoimalla. Kaikista ektomykorritsallisista juurenkärjistä 12 % tuotti proteaasia. Kitin detektiorajan vuoksi heikoimpia aktiivisuuksia ei pystytty määrittämään. Ektomykorritsojen proteaasiaktiivisuus vaihteli kuukausittain välillä 0–12 ?g/m2 humusmaata. Tilastollisesti ei-merkitsevät proteaasintuottohuiput havaittiin keväällä ja syksyllä. Maanesteen proteaasiaktiivisuus vaihteli pääasiassa välillä 0–200 ?g/m2 humusmaata. Aktiivisuus oli korkeimmillaan jäisessä maassa maaliskuussa, jolloin hajonta oli suurta ja proteaasia mitattiin noin 800 ?g/m2 humusmaata. Maanesteen proteaasiaktiivisuudet eivät vastanneet mykorritsojen proteaasiaktiivisuuksia. Puhdasviljelmäksi saatiin eristettyä 17 sienikantaa, joista osaa ei pystytty tunnistamaan lajitasolle. Puhdasviljelmistä osa tuotti proteaasia. Mykorritsallisten juurenkärkien osuus oli suuri keväällä, pieneni alkukesästä ja kasvoi jälleen syksyä kohden. Noin puolet analysoiduista mykorritsamorfotyypeistä tuotti proteaasia. Tärkeimpinä johtopäätöksinä todetaan, että ektomykorritsasienet tuottavat proteaasia maaperässä ja humusmaan maanesteessä on runsaasti proteaasiaktiivisuutta. Käytetty mittausmenetelmä on herkkä ja soveltuu proteaasien mittaamiseen mykorritsoista ja maanesteestä. Sekä mykorritsojen että maanesteen proteaasiaktiivisuuksissa esiintyy mahdollisesti vuodenaikaisvaihtelua.Boreal forest soil contains large nitrogen resources. Most of the nitrogen is bound to humified material and proteins. However, plants can directly utilize only simple nitrogen compounds as ammonium, nitrate and simple amino acids. The amount of these simple nitrogen compounds is very small in forest soil. Trees form ectomycorrhizal symbiosis with a large number of fungi. Ectomycorrhizal fungi receive carbon compounds from host trees and trees receive nutrients from fungi. Some ectomycorrhizal fungi produce proteases which are enzymes that hydrolyze proteins. This symbiosis might be important in utilizing the large nitrogen resources in forest soils and supplying nitrogen to host plants. The main aim of this study was to measure if ectomycorrhizas produce proteases in the field and to find out if the mycorrhizal protease activities change during the year. The aim was also to find out if proteolytic activity is found in the soil fluid and to see if the activities in soil fluid are related to mycorrhizal activities. Mycorrhizal fungi were isolated to form pure cultures and their protease activities were measured and species were identified. As background information mycorrhizal, nonmycorrhizal and dead root tips were calculated to see how their amounts change during the year. Also different kinds of protease producing mycorrhizal morphotypes were calculated. Samples were taken in Hyytiälä Forestry Field Station in Central Finland monthly from March to October. Fifteen soil cores were collected each month. If possible, eight ectomycorrhizas were randomly picked from the pine roots in the humus layer of each soil core. Protease activities were measured from the ectomycorrhizas and from the soil solution obtained from the homogenized humus layer using Protease Fluorescent Detection Kit (PF0100-1KT, SIGMA). Detection limit of the kit was enzyme activity that is equivalent to 5 ng of trypsin control activity. Results were read from the trypsin standard curve so the protease activities of the samples are equivalent to fluorescence of certain amount of trypsin control. Pure cultures were isolated to Hagem’s agar plates and species were identified by doing PCR from the ITS gene region and sequencing. Root tip and morphotype calculations were done by using a microscope. 12 % of all ectomycorrhizal root tips produced proteases. The smallest activities couldn’t be detected because of the detection limit of the kit. Ectomycorrhizal protease production varied between 0–12 ?g/m2 of soil. Statistically non-significant protease production peaks were observed in spring and autumn. The protease activity of the soil fluid varied mainly between 0–200 ?g/m2 of soil. The highest activity was detected in the frozen soil in March, when the variation was large and an average of 800 ?g of protease was measured per m2 of soil. The protease activities in the soil fluids were not related to the protease activities of the ectomycorrhizas. 17 pure cultures were achieved. Some of them couldn’t be identified to species level. Part of the pure cultures produced proteases. Number of mycorrhizal root tips was large in spring, decreasing in early summer and increasing again towards autumn. About half of the mycorrhizal morphotypes produced proteases. The most important conclusions are that ectomycorrhizal fungi produce proteases in the field and a lot of protease activity is also found in the soil fluid. The used method is sensitive and suitable for measuring protease activities directly from mycorrhizal root tips and soil fluid. Seasonal variation in the protease activities may occur both in mycorrhizas and in soil fluid.
Subject: ectomycorrhiza
enzyme activity
forest soil
nitrogen
protease
protease
ektomykorritsa
entsyymiaktiivisuus
metsämaa
proteaasi
typpi


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record