Neurobiology of Parkinson's Disease Gene Pink1 in Danio rerio (Zebrafish)

Show full item record

Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-10-9402-6
Title: Neurobiology of Parkinson's Disease Gene Pink1 in Danio rerio (Zebrafish)
Author: Priyadarshini, Madhusmita
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Medicine, Institute of Biomedicine, Anatomy
Neuroscience center, University of Helsinki
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Belongs to series: Helsinki University Biomedical Dissertations No.190 - URN:ISSN:1457-8433
Abstract: Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder after Alzheimer's disease (AD). The quest for better therapies to modify the progression of PD is still ongoing. During the last two decades, the concept of the etiological basis of PD has changed, which has been driven by genetics, the recognition of familial forms, knowledge of the effects of the environment and toxins, and genome-wide association studies. Although most cases are sporadic, approximately 5-10% of PD cases are due to genetic mutations that give rise to the familial forms. Studies using neurotoxins and also genetic mutations that underlie familial PD have implicated mitochondrial dysfunction in the pathogenesis of PD. Among the different genes associated with familial PD, PTEN-induced putative kinase1 (Pink1), responsible for the autosomal recessive type, is strongly linked to the mitochondria. To investigate in depth the underlying mechanisms of Pink1, we inhibited the function of pink1 in zebrafish using morpholino oligonucleotides (MOs). The MO was first thoroughly characterized with all necessary control experiments to avoid unspecific effects. Since the dopaminergic system is affected in PD, a marker for dopamine, tyrosine hydroxylase (TH), was used to assess damage to the system. Due to a genome duplication event that occurred early in the evolution of teleosts after the divergence from the mammals, two TH non-allelic isoforms were identified in zebrafish: th1 and th2. In the pink1 morphants, both the TH gene isoforms were altered. With in situ hybridization, the loss of th1 was found in the ventral diencephalon (dopaminergic cell groups 5, 6, 11) and th2 was reduced in the caudal hypothalamus (cell group 10b). Similar results were obtained with the cell counting method for TH1 immunoreactive cells. TH-ir indicated the loss of cells in the pretectum (group 7) and the ventral diencephalic cluster represented by cell groups 5,6,11. These pink1 morphants were exposed to subeffective doses of the neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP). This amalgamation of the toxin and genetic manipulation caused a locomotor deficit and also facilitated the loss of TH-ir in the same cell populations in the larval brains as was instigated by pink1 knockdown alone. To investigate the involvement of pink1 in cell damage, we used a two-color gene expression-based microarray and identified a number of genes that were potentially involved in the pathogenic mechanism of the disease. After successful data analysis, the changes in critical genes were successfully validated by quantitative real-time PCR. The gene expression changes in the morphants, identified by the microarray, were rescued by pink1 mRNA injections, suggesting the specific involvement of pink1 in the differentially expressed gene regulation. One of the significant findings was HIF signaling, an important pathway affected by pink1 knockdown. Individual factors and genes in the same pathway were validated by independent methods in the pink1 morphants to reveal whether pink1 affected hif1α or the cascade of events in the signaling pathway. Changes in the VEGF transcripts, erythropoiesis, and reactive oxygen species were observed, as were other antioxidant system genes, including cat and sod2. These pathways may provide new targets for drug development in PD. To study the mechanisms underlying the involvement of pink1 in oxidative stress-mediated PD pathology using zebrafish as a tool, we generated a transgenic line, Tg(pink1:EGFP). The Tol2 transgenic approach was used to generate Tg(pink1:EGFP) by using the zebrafish pink1 promoter. Expression of the pink1 transgene was detected in the telencephalon, midbrain, and rhombencephalon in the CNS, and in the muscle, heart, and liver among the peripheral organs. The transgenic fish line was used to study the effect of oxidative stress. When subjected to a low concentration of hydrogen peroxide (H2O2), which had no effect on the mortality or phenotype of the fish, the transgenic fish showed an increase in pink1 transgene activity in the brain of the larval zebrafish. Oxidative stress-mediated changes in TH expression are valuable for PD study. H2O2 administration did not affect the th1 transcript levels, but it significantly increased pink1 expression and reduced the th2 transcript levels. This transgenic model will be highly useful for drug development and the screening of new potential therapeutic approaches as an in vivo model.ABSTRAKTI Parkinsonin tauti on toiseksi yleisin neurodegeneratiivinen sairaus Alzheimerin taudin jälkeen. Parkinsonin taudin hoitojen kehityksessä olisi tärkeää löytää taudin etenemistä hidastavia lääkkeitä. Käsitys Parkinsonin taudin syistä on muuttunut familiaalisten muotojen löytymisen, geneettisten tutkimusten, ympäristön ja toksisten aineiden vaikutusten tuntemisen ja genomin laajuisten assosiaatiotutkimusten myötä. Familiaalista muotoa esiintyy 5-10 %:lla kaikista Parkinson-potilaista ja sen tiedetään johtuvan mutaatioista eräissä geeneissä. Näiden mutaatioiden tunteminen ja tutkimukset eräillä hermomyrkyillä ovat paljastaneet, että hermosolujen mitokondrioiden toimintahäiriöt ovat keskeisiä Parkinsonin taudin synnyssä. Mutaation mitokondrioiden toiminnalle tärkeässä entsyymissä Pink1 (PTEN-induced putative kinase1) tiedetään olevan Parkinsonin taudin autosomaalisen resessiivisen perinnöllisen muodon aiheuttaja. Väitöskirjatyön tarkoituksena oli selvittää tarkemmin Pink1-entsyymin tehtävää ja merkitystä solussa. Työssä käytettiin morfolino-oligonukleotiditekniikkaa, jolla estettiin pink1-geenin toiminta seeprakalassa. Morfolino-oligonukleotidien vaikutukset karakterisoitiin ensin mahdollisten epäspesifien vaikutusten poissulkemiseksi. Dopamiinijärjestelmän tiedetään tuhoutuvan Parkinsonin taudissa, joten dopamiinia tuottavan tyrosiinihydroksylaasin (TH) esiintymistä käytettiin solutuhon mittarina. Seeprakala kuuluu luukaloihin, joiden genomi on kahdentunut evoluution aikana. Näin ollen tunnistimme seeprakalasta kaksi ei-alleelista muotoa TH-geenistä: th1 ja th2. Molemmissa näistä TH-alamuodoista havaittiin muutoksia seeprakaloissa, joissa pink1-geenin toiminta oli estetty. In situ hybridisaatiotutkimukset osoittivat, että th1-ilmentyminen oli hävinnyt väliaivojen ventraaliosasta (dopamiinihermosoluryhmät 5, 6 ja 11) ja th2-ilmentyminen oli vähentynyt kaudaalisessa hypotalamuksessa (soluryhmä 10b). TH1-positiivisten solujen laskemiseen perustuvat immunovärjäyskokeet antoivat samansuuntaisia tuloksia. TH-solut olivat kadonneet väliaivojen ventraaliosasta solukeskittymästä, joka koostuu soluryhmistä 5,6 ja 11. pink1-vajavaisia seeprakaloja altistettiin MPTP-hermomyrkylle (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine), minkä havaittiin aiheuttavan kaloissa lokomotoriikan häiriöitä ja lisäävän TH-solukatoa entisestään. Geeni-ilmentymiseen perustuvaa kaksivärimikrosirutekniikkaa käytettiin tutkittaessa pink1-geenin merkitystä soluvauriossa. Mahdollisia soluvaurion syntyyn vaikuttaneita ilmentymiseltään muuttuneita geenejä löytyi useita ja tulosten tarkemman analyysin jälkeen ns. kriittisten geenien ilmentymisen muutokset varmistettiin qPCR-menetelmän avulla morfolino-oligonukleotidikäsitellyissä pink1-seeprakaloissa. Jotta pink1-geenin spesifisyys muuttuneissa geeni-ilmentymisissä varmistuisi, ruiskutettiin seeprakalojen muniin pink1-mRNA:ta vähentyneen ilmentymisen palauttamiseksi. HIF-signaalireitin havaittiin olevan yksi tärkeimmistä pink1-geenin toiminnan estämisen myötä muuttuneista solusignaalikaskadeista. Saman signaalireitin kukin yksittäinen tekijä analysoitiin erikseen, jotta saatiin selville vaikuttaako pink1-geenisammutus hif1α-ilmentymiseen vai kokonaiseen tapahtumasarjaan signaaliketjussa. Havaitsimme muutoksia VEGF-geenien ilmentymisessä, erytropoieesiin liittyvissä geeneissä sekä reaktiivisten happiradiaalien ja muiden antioksidanttijärjestelmien geenien ilmentymisessä mukaan lukien geenit cat ja sod2. Mainitut signaalireitit voivat tarjota tulevaisuudessa uusia kohteita Parkinsonin taudin lääkehoitoa varten. Selvittääksemme pink1-geenin merkitystä oksidaativisen stressin aiheuttamassa Parkinsonin taudissa, loimme transgeenisen Tg(pink1:EGFP)-seeprakalalinjan. Linjan luomisessa käytettiin Tol2-transgeenimenetelmää ja pink1-geenin promoottorialuetta. Keskushermostossa pink1-transgeenin todettiin ilmentyvän etuaivoissa, keskiaivoissa ja ydinjatkoksessa. Perifeerisesti pink1-transgeenia havaittiin mm. lihaksissa, sydämessä ja maksassa. Oksidatiivisen stressin aiheuttamiseksi transgeenikalalinjaa altistettiin laimealle vetyperoksidille (H2O2), jolla ei ollut vaikutusta kalojen elinkykyyn tai ilmiasuun. Käsittelyn havaittiin lisäävän pink1-transgeenin aktiivisuutta kalanpoikasten aivoissa. Oksidatiivisen stressin aiheuttaman th-ilmentymisen muutosten tunteminen on tärkeää Parkinsonin taudin tutkimukselle. Havaitsimme, että H2O2 käsittely ei muuttanut th1-ilmentymistä, mutta sen sijaan lisäsi merkitsevästi pink1- ja vähensi th2- ilmentymistä. Uskomme, että tämä uusi transgeenikalamalli on tärkeä työkalu lääkekehitykselle testattaessa uusia potentiaalisia lääkeaineita Parkinsonin taudin hoitoon.
URI: URN:ISBN:978-952-10-9402-6
http://hdl.handle.net/10138/41902
Date: 2013-12-03
Subject: neuroscience
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
priyadarshini_thesis.pdf 1.633Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record