Laminin-511 in human pluripotent stem cells

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-10-9206-0
Title: Laminin-511 in human pluripotent stem cells
Author: Vuoristo, Sanna
Contributor organization: University of Helsinki, Faculty of Medicine, Institute of Clinical Medicine, Tutkimusohjelmayksikkö
Helsingin yliopisto, lääketieteellinen tiedekunta, kliininen laitos
Helsingfors universitet, medicinska fakulteten, institutionen för klinisk medicin
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2013-12-05
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-10-9206-0
http://hdl.handle.net/10138/41984
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Extracellular matrix consists of complex proteins, like collagens, which primarily provide mechanical support and non-collagenous proteins, like fibronectin and laminins (LM). Essentially, extracellular matrix can be divided into interstitial matrix, where the stromal cells, growth factors and ions are embedded or basement membranes, a specialized type of extracellular matrix, which for instance segregates epithelial cells from the surrounding stroma. The first basement membranes of a mouse embryo can be detected already around 3.5 days after fertilization. Laminins initiate basement membrane assembly and are indispensable for a proper basement membrane structure and function during embryogenesis and in adulthood. Human embryonic stem cells have been cultured in vitro for fifteen years and human induced pluripotent stem cells have been reprogrammed from somatic cells since 2007. Originally, human embryonic stem cells were derived in undefined conditions. During the past decade, progress has been made in development of optimized and defined culture conditions for human pluripotent (including embryonic and induced) stem cells. However, the extracellular matrix of human pluripotent stem cells has been poorly understood. An overall aim of this thesis was to study the laminins in human pluripotent stem cells. We found that human embryonic stem cells synthesize LM-111 and -511, the first laminin isoforms synthesized also in mouse embryos. Human embryonic stem cells bound efficiently to LM-511 through integrin α3β1 heterodimer and Lutheran/basal cell adhesion molecule. We showed that undifferentiated human embryonic stem cells could be maintained on LM-511 purified from human cells and that LM-511 was essential also in feeder-dependent stem cell cultures. In large scale, human pluripotent stem cells have been mostly cultured on mouse extracellular matrix preparations. We therefore decided to optimize a novel culture matrix, based on human laminin isoforms secreted by a human carcinoma cell line. Using this novel culture matrix, we were able not only to maintain human pluripotent stem cells but also to reprogram human somatic cells to pluripotency. Adhesion of the newly formed human induced pluripotent stem cell colonies to this matrix was significantly more efficient than to commonly used feeder-free culture systems, suggesting that the matrix could be used in large-scale induced pluripotent stem cell expansion. Finally, we showed that LM α5 synthesis is dependent on the size of the stem cell colony, as well as on the position of the cell in large colonies. The data indicated that LM-511 is mostly produced in context of cell adhesion, cell spreading and migration. Knockdown of LM α5 in human pluripotent stem cells resulted in stress fiber formation in the cells and disorganization in the stem cell colonies. Moreover, the knockdown cells suffered from impaired self-renewal and colony expansion, as compared to the control cells. Taken together, our results suggest that LM-511 maintains human pluripotent stem cells in vitro by mediating cell adhesion, as well as by supporting stem cell morphology and self-renewal, likely via integrin-mediated signaling. This thesis provide essential information about how human pluripotent stem cells modify their adjacent microenvironment, especially LM-511. Based on the primary characterization of human pluripotent cells and their growth requirements, we developed a novel culture matrix, which can be utilized in various stem cell applications, especially in derivation of new induced pluripotent stem cell lines. Finally, our results regarding the functions of LM-511 in undifferentiated human pluripotent stem cells will facilitate the optimization of defined culture and differentiation protocols.Ihmisen erittäin monikykyiset (pluripotent) kantasolut voivat muodostaa kaikkia aikuisen elimistössä esiintyviä solutyyppejä. Tavoite on, että kantasoluista erilaistettuja soluja voitaisiin tulevaisuudessa hyödyntää lääketieteellisissä sovelluksissa, kuten lääkeainetestauksessa tai solusiirteinä. Pluripotenttien kantasolujen ylläpito laboratoriossa on haasteellista, sillä niillä on taipumus erilaistua sattumanvaraisesti tai päätyä solukuolemaan, mikäli viljelyolosuhteet eivät ole optimaaliset. Ihmisen pluripotentteja kantasoluja on perinteisesti ylläpidetty yhteisviljelmissä hiirestä tai ihmisestä peräisin olevien tukisolujen kanssa. Koska kliinisessä käytössä olevat solusiirteet eivät saa missään vaiheessa olla kosketuksissa vieraiden lajien solujen kanssa, kantasolujen kasvatusolosuhteiden kehittäminen on välttämätöntä. Tyvikalvot ympäröivät tai reunustavat soluja, erotellen esimerkiksi epiteelisolut ympäröivästä sidekudoksesta. Tyvikalvot koostuvat proteiinirakenteista, kuten laminiineista (LM). Viittätoista tunnettua laminiinia tuotetaan solutyypin ja kehitysvaiheen mukaan. Solut tarttuvat ulkopuolelleen eritettyihin laminiineihin solukalvon läpäisevillä reseptoreilla. Aktivoituessaan reseptorit aktivoivat muutoksia solunsisäisessä viestinnässä. Väitöskirjatyössä karakterisoitiin ihmisen pluripotenttien kantasolujen tuottamat laminiinit ja tyvikalvoreseptorit sekä tutkittiin LM-511:n merkitystä kantasolujen elinkykyyn ja toimintoihin. Ensin osoitettiin, että kantasolut tuottavat laminiinityyppejä 111 ja 511 ja että ne tarttuvat vahvasti LM-511:een tiettyjä reseptoreita käyttäen. Kantasoluja pystyttiin ylläpitämään LM-511:llä päällystetyillä viljelyalustoilla tarkoin määritellyssä viljelyliuoksessa. Seuraavaksi tutkittiin kantasoluviljelyssä käytettäviä tukisoluja ja havaittiin LM-511:n assosioituvan tukisolujen kykyyn ylläpitää kantasoluja. Saatujen tulosten perusteella kehitettiin uusi kantasoluviljelymenetelmä, joka perustuu ihmisen syöpäsolulinjan tuottamiin laminiineihin. Merkittävää oli, että tämä uusi laminiineihin perustuva alusta soveltui paremmin ihmisen ihosoluista indusoitujen iPS-kantasolujen tuottamiseen kuin tavanomaisesti käytetty alusta. Lopuksi osoitettiin että LM-511:n tuotanto kantasoluissa vaihtelee solujen kasvuvaiheen mukaan ja että LM-511 ylläpitää kantasolujen jakautumista ja ominaispiirteitä. Tässä väitöskirjatyössä on osoitettu yhden tyvikalvoproteiinin, LM-511:n, keskeinen merkitys ihmisen pluripotenttien kantasolujen ominaisuuksien ylläpitämisessä. Tuloksilla on käytännön merkitystä näiden solujen lääketieteellisten sovellusten jatkokehitykselle.
Subject: biolääketiede
Rights: Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record