Ohran hordeiinien kokojakauman määritys asymmetrisellä poikittaisvirtauskenttävirtausfraktioinnilla

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201507212140
Title: Ohran hordeiinien kokojakauman määritys asymmetrisellä poikittaisvirtauskenttävirtausfraktioinnilla
Alternative title: Determination of molecular weights of polymeric barley proteins by asymmetrical flow field-flow fractionation combined with MALS/UV/RI
Author: Perkiö, Pasi
Other contributor: Helsingin yliopisto, Maatalous-metsätieteellinen tiedekunta, Elintarvike- ja ympäristötieteiden laitos
University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Food and Environmental Sciences
Helsingfors universitet, Agrikultur- och forstvetenskapliga fakulteten, Institutionen för livsmedels- och miljövetenskaper
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2013
Language: fin
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201507212140
http://hdl.handle.net/10138/42317
Thesis level: master's thesis
Discipline: Livsmedelsteknologi (spannmålsteknologi)
Food Technology (Cereal technology)
Elintarviketeknologia (viljateknologia)
Abstract: Tutkielman kirjallisuusosiossa tarkasteltiin ohran (Hordeum vulgare) prolamiineja eli hordeiineja ja niiden teknologisia ominaisuuksia. Lisäksi perehdyttiin eluutiomenetelmä kenttävirtausfraktiointiin ja proteiinien moolimassajakauman määrittämiseen moolimassaselektiivisillä sekä spektrofotometrisillä menetelmillä. Kokeellisessa osiossa määritettiin uuttomenetelmä, jolla pyrittiin uuttamaan suuret polymeeriset hordeiinit rikkomatta niiden sisältämiä rikkisiltoja. Hordeiinien moolimassa, molekyylikoko ja -muoto määritettiin AF4:iin (engl. asymmetric flow field-flow fractionation) kytketyillä MALS-, UV- ja RI-ilmaisimilla. Hordeiinien uuttoliuokseksi valittiin 40-prosenttinen 1-propanoli ja polymeeristen hordeiinien uuttoa tehostettiin sonikoimalla näyte. Käytetty uuttomenetelmä liuotti suurimman osan ohran hordeiineista. Ajoliuoksena AF4:ssa käytettiin 20-prosenttista 1-propanolia, etteivät laitteiston kanavat vahingoittuisi. Ohrauutteen ekstinktiokerroin ? mitattiin 280 nm:n aallonpituusalueella 20-prosenttisessa 1-propanolissa ja ?n/?c-arvo määritettiin laskennallisesti. Mittaustuloksien mallintamiseen käytettiin Berry-yhtälöä. Ohrauutteiden AF4 fraktogrammeista havaittiin viisi selkeää piikkiä, jotka elektroforeesin avulla tunnistettiin koostuvan aggregoituneista monomeerisista ja polymeerisistä hordeiineista sekä pienistä määristä albumiineja, globuliineja ja sonikoinnissa pilkkoutuneita proteiineja. Hordeiinien muotoa tutkittiin AF4:lla saatujen massafraktaalin (v) ja polydispersiteetti-indeksin (PDI) avulla. Hordeiinien todettiin muodostavan 20-prosenttisessa 1-propanolissa epäsäännöllisen muotoisia ja sauvamaisia aggregaatteja. Virhettä tuloksiin aiheutti mitattu ekstinktiokerroin ja laskennallinen ?n/?c-arvo sekä valonsirontailmaisimen ylikuormittuminen. Näyteajojen saanto oli välillä 19–26 %. Alhainen saanto selittyy hordeiinien takertumisella ruiskusuodattimeen ja AF4:n virtauskanavan ultrasuodatusmembraaniin sekä saannon laskemiseksi käytetyn laskentamallin soveltumattomuudella suurille aggregaateille. Tutkimuksessa osoitettiin AF4:n yhdistettynä MALS/UV-ilmaisimiin soveltuvan hordeiinien moolimassan, koon ja muodon analysoimiseen. Sen sijaan hordeiinien analysointi AF4:lla 20-prosenttisessa 1-propanolissa osoittautui vaikeaksi, sillä hordeiinit eivät pysyneet liukoisessa muodossa pitkiä aikoja, vaan muodostivat suuria proteiiniaggregaatteja.The aim of the literature review was to examine barley’s (Hordeum vulgare) alcohol-soluble proteins – hordeins and their technological attributes. Additionally, applicability of flow field flow fractionation (FFF) separation method as well as spectrophotometric and light scattering methods for protein characterization was under investigation. The objective of the experimental research was to determine a suitable extraction method for hordeins and subsequent analysis of their molecular weight distribution, size and conformation by the use of AF4 (asymmetric flow field flow fractionation) in combination with MALS-, UV- and RI-detectors. 40 % 1 propanol combined with mild sonication treatment proved to be the most efficient method to extract hordeins from barley flour. In order to prevent deterioration of the FFF channels the solvent had to be diluted to 20 %. Same dilution was used to measure hordeins’ extinction coefficient and to calculate ?n/?c theoretically. Berry plot was found to be the most suitable fit for the data analysis. Extracted hordeins were analysed with SDS PAGE. Extracts contained monomeric C, B and ? hordeins and polymeric B, D and ? hordeins. Also, small amounts of albumins, globulins and hydrolysed proteins were present. Extracts’ fractograms had five distinctive peaks. All of the peaks’ mass fractals and polydispersity indices were above 1, which means analysed aggregates were polydisperse and shaped as complex rods. This can be explained by 1 propanol influenced protein aggregation. Some inference in light scattering was identified in the MALS detector signal. This and the use of measured extinction coefficient and calculated index of refraction caused some errors in the data. The low sample yield (19–26 %) can be explained by the hordeins’ adhering to a syringe filter and adsorbing to the surface of AF4’s ultrafiltration membrane. Also, the use of over simplifying mathematical model to calculate the results and yield could cause some errors in the results. This study showed that it is possible to study Mw, size and conformation of polymeric hordeins with AF4 combined with MALS/UV-detectors and that hordeins form big aggregates in 20 % 1 propanol. For MALS proteins should be extracted in a solvent that will not interfere with subsequent analysis and proteins net charge, which creates a challenge to find proper solvent for hordeins. Nevertheless AF4 proved to be useful and delicate tool for characterizing cereal polymeric proteins.
Subject: barley
protein
prolamin
hordein
molar mass
field-flow fractionation
multi-angle light scattering
ohra
proteiini
hordeiini
prolamiini
moolimassa
kenttävirtausfraktiointi
valonsironta


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Perkio.pdf 947.7Kb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record