Intracellular distribution of drugs (Literature review) : Subcellular fractionation protocol to isolate plasma membrane and cytoplasm of MDCKII cells (Experimental work)

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151245
Title: Intracellular distribution of drugs (Literature review) : Subcellular fractionation protocol to isolate plasma membrane and cytoplasm of MDCKII cells (Experimental work)
Alternative title: Lääkeaineiden solunsisäinen jakautuminen (kirjallisuuskatsaus) : Solunosien fraktionaatioon perustuva menetelmä plasma membraanin ja sytoplasman eristykseen MDCKII -soluista (erikoistyö)
Author: Huusko, Karoliina
Other contributor: Helsingin yliopisto, Farmasian tiedekunta
University of Helsinki, Faculty of Pharmacy
Helsingfors universitet, Farmaceutiska fakulteten
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2013
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151245
http://hdl.handle.net/10138/42412
Thesis level: master's thesis
Discipline: Biofarmaci
Biopharmacy
Biofarmasia
Abstract: Intracellular drug sequestration is useful to understand when designing new drugs with intracellular targets. The knowledge of the intracellular distribution can also help to understand the side effects and pharmacokinetics of a drug, as well as the lack of response in e.g. some multidrug resistant cancer cells. Intracellular concentrations are also important to know when predicting the role of active transport in the overall transport process when binding site of the transporter is intracellular. The literature review describes the mechanisms causing intracellular drug sequestration along with the consequences of intracellular drug sequestration and methods that are used to study it. Alterations of intracellular distribution of anticancer drugs in multidrug resistant cancer cells are also described as an example of the many factors affecting the distribution pattern of the drugs inside cells. Understanding these mechanisms is valuable when designing strategies to overcome the multidrug resistance. The most commonly applied methods for studying intracellular concentrations of drugs are based on fluorescence microscopy. In experimental work, subcellular fractionation protocol is introduced and applied to determine the concentration of CDCF, clotrimazole and celiprolol in vitro in the plasma membrane and cytoplasm of MDCKII cells. CDFC and celiprolol are substrates of the MDR1 transporter and clotrimazole is an inhibitor. Concentrations in the fractions were measured in wild type cells and in MDR1-transfected cells with and without MDR1 inhibitor verapamil to see if the transporter had an effect on the concentrations. Also the effect of lipophilicity of the drug on partition between plasma membrane and cytoplasm was reviewed. Celiprolol showed a typical behaviour of the MDR1 substrate whereas CDCF and clotrimazole did not. Clotrimazole as a lipophilic compound was accumulated more to the plasma membrane than less lipophilic CDCF and celiprolol. Lipophilicity affected also to the ratio of Km (or Ki)(determined from the concentration in extracellular fluid) and Km (or Ki)(membrane) (determined from the plasma membrane concentration) values, with clotrimazole Ki(membrane) value being larger than respective Ki value, and CDCF and celiprolol Km(membrane) values being smaller than their respective Km values.Lääkeaineiden solunsisäinen jakautuminen on hyödyllistä ymmärtää kehitettäessä uusia lääkkeitä, joiden vaikutuskohteet ovat solunsisäisiä. Tieto solunsisäisestä jakautumisesta voi auttaa myös ymmärtämään lääkkeiden haittavaikutuksia ja farmakokinetiikkaa, sekä tehon puutetta esim. lääkeaineille vastustuskykyisissä syöpäsoluissa. Solunsisäiset pitoisuudet ovat myös tärkeitä ennustettaessa aktiivisen kuljetuksen osuutta koko lääkeaineen kulkeutumisprosessissa, silloin kun kuljettajaproteiinin sitoutumiskohta on solun sisällä. Kirjallisuuskatsauksessa tarkastellaan lääkeaineen solunsisäisen jakautumisen mekanismeja, seurauksia joita jakautumisella on ja tapoja joita käytetään sen tutkimiseen. Osassa lääkkeille vastustuskykyisistä syöpäsoluista lääkeaineen solunsisäinen jakautuminen on muuttunut ja kirjallisuuskatsauksen lopussa tarkastellaan näitä tapauksia esimerkkeinä havainnollistamaan monia jakautumiseen vaikuttavia tekijöitä. Näiden tekijöiden ja mekanismien ymmärtäminen on tärkeää suunniteltaessa tapoja vastustuskykyisten syöpäsolujen tuhoamiseen. Yleisimmin käytetyt tavat tutkia lääkkeiden solunsisäisiä pitoisuuksia perustuvat fluoresenssimikroskopiaan. Erikoistyössä esitellään menetelmä, jossa eri sentrifugaationopeuksia käyttäen erotellaan solunosia toisistaan. Menetelmää hyväksikäyttäen määritettiin CDCF:n, klotrimatsolin ja seliprololin pitoisuudet in vitro MDCKII -solujen plasma membraanissa ja sytoplasmassa. CDCF ja seliprololi ovat MDR1-proteiinin substraatteja ja klotrimatsoli on sen inhibiittori. Osioiden pitoisuudet mitattiin villityypin soluissa ja MDR1-proteiinia ilmentävissä soluissa MDR1-inhibiittori verapamiilin kanssa ja ilman sitä, jotta nähtiin onko kuljettajaproteiinilla vaikutusta pitoisuuksiin. Myös rasvaliukoisuuden vaikutusta lääkeaineiden jakautumiseen plasma membraanin ja sytoplasman välillä tutkittiin. Seliprololi käyttäytyi kokeissa kuten MDR1-substraatin oletetaan käyttätyvän, mutta CDCF ja klotrimatsoli eivät. Rasvaliukoisena yhdisteenä klotrimatsoli kertyi enemmän plasma membraaniin kuin vähemmän rasvaliukoiset CDCF ja seliprololi. Rasvaliukoisuus vaikutti myös Km (tai Ki)(määritetty solunulkoisen nesteen pitoisuuksista) ja Km (tai Ki)(membraani) (määritetty pitoisuuksista plasma membraanissa) suhteeseen, siten että rasvaliukoisella klotrimatsolilla Ki(membraani) oli suurempi kuin vastaava Ki ja vähemmän rasvaliukoisilla CDCF:llä ja seliprololilla Km(membraani) oli pienempi kuin vastaava Km.
Subject: MDR1
MDCKII
intracellular distribution
drug sequestration
subcellular fractionation
solunsisäinen jakautuminen
lääkeaineiden jakautuminen
solunosien fraktiointi


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
gradu Huusko.pdf 1.287Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record