Reverse-Phase protein microarray

Abstract

Reverse-phase protein microarray, RPMA, is a novel and promising technology for proteomic profiling. The low sample consumption, high-throughput format, high sensitivity and good precision make RPMA attractive tool for clinical use. In RPMA, cellular lysates obtained from various sources (e.g. clinical samples, cell lines) are arrayed onto a substratum as a small spots such that an array is comprised of hundreds to thousands of different samples. The array is incubated with a capture molecule (e.g. antibody) that is validated to recognize the analyte of interest. Signal is created by labelled secondary antibody and the signal is detected by colorimetry, chemiluminescence or fluorescence methods.

The literature part introduces the RPMA technology and its applications. RPMA have been utilized in versatile applications for example in cell signal pathway profiling, drug discovery and discovery and validation of biomarkers. In the future, it is hoped to allow individual therapy regimes and the evaluation of treatment efficacy.

The aim of the experimental part was to culture various cell lines and prepare lysates for RPMA. The lysates were prepared of ARPE-19, HepG2, Hepa-RG, SKOV-3-ip1, SKOV-3, Caco-2, hCMEC/D3, HCE and D-407 cell cultures. The lysates were stored in -80 °C for subsequent use in RPMAs.

The purpose was to optimize the method and based on the optimization studies, to print one RPMA. Cell lysates were arrayed onto nitrocellulose coated glass slide using Nano-Plotter (Gesim)-device which allows automated sample printing. β-actin and α-tubulin proteins were assessed from the samples. To create the signal, fluorescence dye was used, and detected at the visible wavelengths.

Based on this study, more optimization is required. The detection method used in the RPMA was not optimal, but the experiment showed promising potential. By taking into account the development issues, the method performance can be significantly improved. Of these issues, perhaps the most important is to use infrared region for the signal detection instead of visible wavelengths.

Reverse-phase protein microarray, RPMA, on uusi ja lupaava proteomiikan high-throughput-tutkimusmenetelmä. Erityisesti menetelmän nopeus, herkkyys ja tarkkuus, sekä analyysiin tarvittava pieni näytemäärää tekevät siitä houkuttelevan. Menetelmä soveltuukin erityisen hyvin kliinisten näytteiden analysointiin, joissa näytemäärä on usein rajallinen. RPMA analyysissä näytteistä valmistetaan solulysaatteja, jotka spotataan levylle pieninä pisteinä. Yksi microarray koostuu sadoista, jopa tuhansista erilaisista näytteistä. Tutkittava proteiini määritetään näytteistä spesifisen vasta-aineen avulla, ja signaali saadaan aikaan merkkiaineella leimatulla sekundäärisellä vasta-aineella. Kolorimetri, kemiluminesenssi ja fluoresenssi ovat yleisimmin käytetyt menetelmät signaalin määritykseen. Kirjallisuuskatsaus syventyy RPMA menetelmään; sen teknologisiin ominaisuuksiin ja käytännön toteutukseen. Lisäksi käydään läpi tutkimuksia, joissa RPMA menetelmää on hyödynnetty, sekä selvitetään mahdollisia käyttökohteita. Näitä ovat esimerkiksi solusignaloinnin tutkiminen, biologisten merkkiaineiden etsiminen ja validointi sekä menetelmän hyödyntäminen lääkekehityksessä. Tulevaisuudessa sitä voidaan mahdollisesti hyödyntää yksillölisen lääkehoidon suunnittelussa ja hoidon tehon tarkkailussa. Kokeellisen osan tarkoituksena oli kasvattaa eri solulinjoja, ja valmistaa niistä solulysaatteja RPMA varten. Lysaatit valmistettiin ARPE-19, HepG2, Hepa-RG, SKOV-3-ip1, SKOV-3, Caco-2, hCMEC/D3, HCE ja D-407 soluviljelmistä. Valmiit lysaatit pakastettiin odottamaan myöhempää käyttöä. Tarkoituksena oli lisäksi optimoida menetelmää ja valmistaa optimoinnin perusteella yksi RPMA. Lysaatteja spotattiin nitroselluloosalla päällystetylle lasilevylle käyttäen Nano-Plotter (Gesim)-laitetta näytteiden automaattiseen spottaukseen. Näytteistä määritettiin β-actin ja α-tubulin proteiineja. Signaalin aikaansaamiseksi käytettiin fluoresoivaa merkkiainetta, joka havaittiin näkyvän valon aallonpituudella. Tulosten perusteella optimoitavaa on edelleen, etenkin signaalin määrityksessä. Kokeen perusteella saatiin kuitenkin lisää tietoa kehityskohteista, jotka huomioimalla menetelmän toimivuutta voidaan parantaa huomattavasti. Näistä ehkä tärkein on signaalin määrittäminen näkyvän valon aallonpituuden sijaan infrapunavalon aallonpituudella.