Isothermal nucleic acid amplification technologies for point of care - diagnostics (Literature review) : The impact of the composition of the invading oligonucleotide in Strand Invasion Based Amplification (SIBATM) technology (Experimental work)

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151254
Title: Isothermal nucleic acid amplification technologies for point of care - diagnostics (Literature review) : The impact of the composition of the invading oligonucleotide in Strand Invasion Based Amplification (SIBATM) technology (Experimental work)
Alternative title: Isotermiset nukleiinihappomonistusteknologiat lähidiagnostiikassa (kirjallisuuskatsaus) : Invaasio oligonukleotidin koostumuksen merkitys SIBATM-teknologiassa (erikoistyö)
Author: Ryhänen, Tiia
Other contributor: Helsingin yliopisto, Farmasian tiedekunta
University of Helsinki, Faculty of Pharmacy
Helsingfors universitet, Farmaceutiska fakulteten
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2014
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151254
http://hdl.handle.net/10138/44690
Thesis level: master's thesis
Discipline: Biofarmaci
Biopharmacy
Biofarmasia
Abstract: Nucleic acid amplification technologies are widely used in the field of molecular diagnostics and biological research for amplifying and detecting specific nucleic acid sequence. Polymerase chain reaction (PCR) is the most established nucleic acid amplification technology providing a fast, sensitive and highly specific method to amplify nucleic acids. But, as a "point-of-care" - diagnostic tool, PCR still remains limiting due to the need to use complex and heavy instrument. This disadvantage of PCR has lead to development of nucleic acid amplification technologies, which are possible to utilize with a simple and cost-effective device. PCR requires thermocycling between three different temperatures, while these isothermal technologies are possible to use in a constant and low temperature. Over ten different isothermal nucleic acid amplification technologies are described in the literature within past two decades. This literature review is focused on six of these existing isothermal technologies. They are briefly described and their potential applications to point-of-care diagnostics are discussed. The experimental part of the thesis focuses on improving the sensitivity, speed and robustness of isothermal nucleic acid amplification, SIBA technology. This was achieved by investigating the optimum configuration of the invasion oligonucleotide (IO) required dissociation of target DNA duplex. The invasion oligonucleotide contains of three functionally district regions; the seeding-, DNA- and a 2'-O- methyl RNA region. The IO can also contain a few non-cognate bases at the 3'end, inverted dt. It was researched how the length of the seeding- and DNA regions, and the ratio of pyrimidine in the seeding region affect to the amplification speed and specificity. SIBA reaction was tested also with IOs where the 2'-O- methyl RNA bases of the IO were partially replaced by 2'-fluoro RNA bases and the inverted dT removed. The results revealed that a higher ratio of pyrimidine in the seeding region speed up the nucleic acid amplification reaction, but too high ratio can also induce non-specific amplification. The optimal length of the seeding region lies somewhere between 3 and 18 bases. The optimal length of the DNA region is around 35 bases. This study also showed that the inverted dT blocker of the IO is unnecessary in SIBA, and by replacing 2'-O- methyl RNA with 2'-fluoro RNA bases is possible to improve the amplification of target template with mutations. Results presented in this thesis have helped to improve existing knowledge of SIBA-assay design. Future work could focus on investigating the impact of the IO's 2'-O- methyl RNA region.Polymeraasiketjureaktio (PCR) on hyvin yleisesti käytetty menetelmä diagnostiikassa. Se on nopea, herkkä ja hyvin spesifinen menetelmä, jonka avulla voidaan monistaa tiettyjä nukleiinihappoalueita. Lähidiagnostiikassa PCR:a on kuitenkin hankala käyttää, sillä itse laite on monimutkainen ja yleensä hyvin suuri. Viimeisen kahden vuosikymmenen aikana on kehitetty useita uusia, paremmin lähidiagnostiikkaan sopivia, isotermisiä nukleiinihappomonistusteknologioita. Niiden avulla nukleiinihappomonistus voidaan suorittaa tasaisessa ja yleensä melko alhaisessa lämpötilassa, kun taas PCR vaatii jatkuvaa lämpötilan vaihtelua kolmen eri lämpötilan välillä. Tässä kirjallisuuskatsauksessa esitellään lyhyesti kuusi erilaista isotermistä nukleiinihappomonistusteknologiaa ja niiden soveltuvuutta lähidiagnostiikkaan pohditaan. Tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia SIBA teknologiassa käytettävän invaasio oligonukleotidin (IO) koostumusta ja sen vaikutusta nukleiinihappomonistusreaktion nopeuteen, spesifisyyteen ja herkkyyteen. IO:n tarkoituksena on parantaa reaktion spesifisyyttä avaamalla DNA-kaksoisjuoste kohdealueelta. Se koostuu kolmesta osiosta; seeding-, DNA- ja metyloitu 2'-O- RNA-osio. IO:ssa voi olla myös 3-terminaalipäädyssä käänteinen dT-blokkeri. Tässä työssä tutkitaan seeding- ja DNA alueiden pituuksien, sekä seeding-alueen pyrimidiinin määrän vaikutuksia reaktion nopeuteen ja spesifisyyteen. Reaktiota testataan myös IO:lla, joissa ei ole käänteistä dT-blokkeria, sekä IO:lla, joiden metyloituja 2'-O- RNA emäksiä on korvattu 2'-fluoro RNA emäksillä. Johtopäätöksenä voidaan sanoa, että SIBA nukleiinihappomonistusreaktio nopeutuu, kun pyrimidiinin määrää lisätään IO:n seeding alueessa. Kuitenkin liian korkea määrä pyrimidiinä voi lisätä epäspesifistä monistusreaktiota helpommin. Toimivan seeding alueen pituus on 3-18 emästä. Optimaalisin pituus IO:n DNA-alueelle on tuloksien mukaan 35 emästä. Kokeissa osoitettiin myös, että käänteinen dT-blokkeri on tarpeeton SIBA teknologiassa ja että 2'-fluoro RNA emäksiä sisältävä IO toimii paremmin jos kohdevastinjuosteessa on mutaatio. Saadut tulokset auttavat uusien invaasio oligonukleotidien suunnittelussa. Seuraavaksi olisi hyvä tutkia metyloidun RNA-osion pituuden ja koostumuksen vaikutuksia reaktioon sekä seeding alueen emäsjärjestyksen merkitystä reaktiossa.
Subject: SIBA
strand invasion based amplification
isothermal nucleic acid amplification
point of care diagnostics
invasion oligonucleotide
isoterminen nukleiinihappomonistus
lähidiagnostiikka
invaasio oligonukleotidi


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record