TCDD:n ja rajoitetun ruokinnan vaikutus AMPK:n ja Scd1:n lähetti-RNA:n ilmentymiseen rotan maksakudoksessa

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151702
Title: TCDD:n ja rajoitetun ruokinnan vaikutus AMPK:n ja Scd1:n lähetti-RNA:n ilmentymiseen rotan maksakudoksessa
Author: Wjuga, Anna
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Veterinary Medicine, Department of Food and Environmental Hygiene
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2009
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151702
http://hdl.handle.net/1975/9350
Thesis level:
Abstract: 2,3,7,8-Tetrachlorodibentso-p-dioksin (TCDD) is the most potent congener of the group of dioxins. It forms as a byproduct or impurity in many chemical processes. TCDD is enriched in the food chain and people are exposed to it in small portions chronically mainly by nutrition. TCDD has many toxic impacts on humans and animals which are mediated by the cellular aryl hydrocarbon -receptor. In spite of decades of research the toxic mechanisms of TCDD are poorly known. By investigating the toxicity of TCDD with large doses in experimental animals we will gain more insight into its toxic mechanisms and into its risks to humans. An important form of acute toxicity of TCDD is the wasting syndrome in which rats eat less, lose weight and finally die or after a sublethal dose stay thinner than littermates. The mechanism by which TCDD causes the wasting syndrome is unclear. Two central enzymes that take part in the regulation of the body's energy balance are the adenosine monophosphate activated protein kinase (AMPK) and stearoyl-CoA-desaturase 1 (Scd1). Changes in the expression or the regulation of their action could well be related to the wasting syndrome. The goal of this experiment was to compare in liver the mRNA expression of AMPK, Scd1 and control genes which are widely used in quantitative PCR in dioxin-sensitive Long-Evans (L-E) and resistant Han/Wistar (H/W) rat strains after a large (lethal to the sensitive strain) TCDD dose at early phases of intoxication (days 1, 4 and 10). There was also a L-E rat group whose feed was restricted to mimic the wasting caused by TCDD. The goal of the feed restriction was to separate the possible primary effect of TCDD from a secondary effect, depletion of energy. RNA was isolated from liver samples and the cDNA was made from isolated RNA with M-MLV-derived reverse transcriptase enzyme using oligo dT and random hexamer primers. The mRNAs of Scd1-enzyme and the control genes in the liver samples were measured using real-time quantitative PCR and specific primers. At 10 days feed restriction lowered significantly the expression of AMPK mRNA in L-E-rats. At 4 and 10 days feed restriction lowered significantly also the expression of Scd1 mRNA; on day 10 the mRNA level of control rats was about 10,000-fold higher. At day 1 TCDD elevated the expression of Scd1-enzyme. TCDD did not cause a significant decrease in the expression of Scd1-enzyme on day 4 and on day 10 the decrease was significantly less, about 1/10 of the level in control rats. These findings suggest that either TCDD inhibits the strong decrease of AMPK and Scd1 caused by energy deficiency or it causes an induction of AMPK and Scd1 which in turn is countered by the weight loss caused by the wasting syndrome. Overall it seems that rats exposed to TCDD do not recognize the energy depletion and their hepatocytes do not turn on the energy sparing mode of metabolism. Feed restriction and TCDD affected clearly also the expression of the control genes GAPDH, Pgk1 and Bact which were believed to be stable. The use of control genes which are linked to the regulation of cellular energy balance is risky in long-term feed restriction experiments.2,3,7,8-Tetraklooridibentso-p-dioksiini (TCDD) on dioksiiniryhmän voimakkain myrkky, jota syntyy sivutuotteena tai epäpuhtautena monissa kemiallisissa prosesseissa. TCDD rikastuu ravintoketjussa ja ihmiset altistuvat hyvin pienille annoksille kroonisesti ravinnon välityksellä. TCDD:llä on useita solunsisäisen aryylihiilivety-reseptorin välittämiä akuutteja ja kroonisia toksisia vaikutuksia ihmisiin ja eläimiin, mutta vuosikymmenien tutkimuksesta huolimatta sen toksisuusmekanismit tunnetaan edelleen huonosti. Tutkimalla TCDD:n toksisuutta suurilla annoksilla koe-eläimillä saadaan sen vaikutusmekanismeista lisää tietoa ihmisiin kohdistuvien riskien arviointia varten. TCDD:n akuutin toksisuuden merkittävä ilmenemismuoto on näivetysoireyhtymä, jossa rotat vähentävät syömistä, laihtuvat ja lopulta kuolevat tai subleetaalin annoksen jälkeen pysyvät jatkuvasti lajitovereitaan hoikempina. Vaikutusmekanismi, jolla TCDD aiheuttaa näivetysoireyhtymää, on epäselvä. Kaksi keskeistä elimistön energiatasapainon säätelyyn osallistuvaa entsyymiä ovat adenosiinimonofosfaatin aktivoima proteiinikinaasi (AMPK) sekä stearyyli-CoA-desaturaasi 1 (Scd1). Muutokset näiden entsyymien ilmentymisessä tai niiden toiminnan säätelyssä voisivat hyvinkin liittyä näivetysoireyhtymään. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli vertailla maksassa ekspressoituvien AMPK:n ja Scd1:en sekä yleisesti kvantitatiivisessa PCR:ssä kontrolligeeneinä käytettyjen entsyymien lähetti-RNA:n ilmentymisen eroja dioksiiniherkällä Long-Evans- (L-E) ja resistentillä Han/Wistar-rottakannalla (H/W) suuren (herkälle kannalle letaalin) TCDD-annoksen jälkeen myrkytystilan alkuvaiheissa (päivinä 1, 4 ja 10). Kokeessa oli mukana L-E-rottaryhmä, jonka ruokintaa rajoitettiin TCDD:n aiheuttaman näivettymisen tapaan. Ruokinnan rajoituksella pyrittiin erottamaan TCDD:n mahdollinen primaarinen vaikutus sekundaarisesta, energian saannin vähenemisestä seuraavasta vaikutuksesta. Maksanäytteistä eristetty RNA muutettiin käänteiskopioijaentsyymin avulla komplementaariseksi cDNA:ksi käyttäen oligo dT- sekä sattumanvaraisalukkeita (random hexamers). Näytteiden sisältämä Scd1 –entsyymin ja kontrolligeenien lähetti-RNA:n määrä mitattiin reaaliaikaisella kvantitatiivisellä PCR-menetelmällä käyttäen spesifisiä alukkeita. Päivänä 10 ruokinnan rajoitus alensi merkitsevästi AMPK –entsyymin lähetti-RNA:n ilmentymistä maksassa dioksiiniherkillä L-E-rotilla. Neljän ja kymmenen päivän ruokinnan rajoitus alensi myös merkitsevästi Scd1 –entsyymin ilmentymistä; päivänä 10 kontrollirottien lähetti-RNA:n taso oli noin 10000-kertainen. Päivänä 1 TCDD nosti Scd1 –entsyymin ekspressiota. TCDD ei ruokinnan rajoituksesta poiketen aiheuttanut merkitsevää laskua Scd1 –entsyymin ekspressiossa päivänä 4 ja päivänä 10 lasku oli huomattavavasti vähäisempi, noin 1/10 kontrollirottien tasosta. Nämä löydökset viittaavat siihen, että TCDD joko inhiboi energiavajeen aiheuttamaa voimakasta AMPK:n ja Scd1:n alentumista tai saa aikaan AMPK:n ja Scd1:en induktion, jonka puolestaan näivetysoireyhtymän aiheuttama painon aleneminen kumoaa. Kokonaisuutena vaikuttaisi siltä, että TCDD:lle altistettujen rottien elimistö ei tunnista energiavajetta, eivätkä niiden maksasolut siirry energiaa säästävään metaboliaan. Ruokinnan rajoitus ja TCDD vaikuttivat myös selvästi stabiileiksi uskottujen solun energiatasapainoon liittyvien kontrolligeenien, GAPDH:n, Pgk1:n sekä Bact:n ekspressioon. Solun energiatasapainon säätelyyn liittyvien kontrolligeenien käyttö on arveluttavaa pitkäaikaisissa ruokinnanrajoituskokeissa.
Subject: TCDD
AMPK
Scd1
Han/Wistar
Long-Evans
Discipline: Food and Environmental Toxicology
Ympäristö- ja elintarviketoksikologia
Livsmedels- och miljötoxikologi


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Wjuga_Anna_tiivistelmat.pdf 23.82Kb PDF View/Open
Wjuga_Anna_tutkielma-1.pdf 292.5Kb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record