Runsasrasvaisen- ja vähärasvaisendieetin sekä kalorirajoituksen ja resveratrolin vaikutus SIRT1?proteiinin määrään hiirten sydämissä ja maksoissa Juha Lempiäinen, lääk. yo Opiskelijanumero: 013027339 Helsinki 16.2.2008 Tutkielma juha.lempiainen@helsinki.fi Ohjaaja: Professori Eero Mervaala HELSINGIN YLIOPISTO Biolääketieteen laitos, Farmakologia i Lääketieteellinen tiedekunta HELSINGIN YLIOPISTO HELSINGFORS UNIVERSITET Tiedekunta/Osasto - Fakultet/Sektion ? Faculty Lääketieteellinen tiedekunta Laitos - Institution ? Department Biolääketieteen laitos Tekijä - Författare ? Author Juha Lempiäinen Työn nimi - Arbetets titel ? Title Runsasrasvaisen- ja vähärasvaisendieetin sekä kalorirajoituksen vaikutus SIRT1? proteiinin määrään hiirten sydämissä ja maksoissa Oppiaine - Läroämne ? Subject Lääketiede; Biolääketiede; Farmakologia Työn laji - Arbetets art ? Level Tutkimustyö Aika - Datum ? Month and year 27.8.2008 Sivumäärä -Sidoantal - Number of pages 29 Tiivistelmä - Referat ? Abstract Lihavuus on kasvava ongelma länsimaissa. Siihen liittyy useita metabolisia muutoksia, jotka johtavat erilaisiin kohde-elinvaurioihin. Vaurioiden mekanismien tunnistaminen on tärkeää, jotta niiden ehkäisyyn voidaan kehittää uusia elintapa- ja lääkehoitoja. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää ravinnon rasvamäärän, resveratrolin ja kalorirajoituksen vaikutuksia hiirten sydämissä ja maksoissa sekä määrittää näiden vaikutus SIRT1 ? proteiinin määrään kyseisissä kudoksissa. Tutkimuksessa vertailtiin Western Blot ? menetelmän avulla SIRT1:n pitoisuutta hiirten sydämissä ja maksoissa. SIRT1:n lokalisaatio osoitettiin immunohistokemiallisen värjäyksen avulla. Sydänlihassolujen hypertrofiaa arvioitiin mikroskoopin avulla HE ? värjätyistä leikkeistä. Resveratrolin vaikutus sydänlihassolujen hypertrofian asteeseen jäi vähäiseksi. Kalorirajoitus lisäsi SIRT1:n määrää sekä sydämessä että maksassa ja esti sydänlihassolujen hypertrofian. Tutkimus tarjoaa hyvän pohjan selvittää laajemmin resveratrolin vaikutusta SIRT1:n aktivaatioon ja sitä kohde-elinvaurioiden estoon. (111 sanaa) Avainsanat ? Nyckelord ? Keywords SIRT1, kalorirajoitus, resveratroli, sydän, maksa Säilytyspaikka ? Förvaringställe ? Where deposited Terkon avoin julkaisuarkisto / TDS Muita tietoja ? Övriga uppgifter ? Additional information ii 1 Johdanto 1 2 Tutkimusaineisto 2 3 Menetelmät 4 3.1 Näytteiden jauhaminen ja eristys 5 3.2 Proteiinin märitys Bradfordin menetelmällä 5 3.3 Näytteiden laimentaminen 6 3.4 Näytteiden keittäminen 7 3.5 Proteiinien erottelu Western Blot-menetelmällä 7 3.6 Proteiinien blottaus membraanille 8 3.7 Blokkaus 8 3.8 Vasta-aineiden kiinnittäminen 9 3.9 Viivojen lukeminen membraanilta 10 3.10 Tulosten käsittely tietokoneella 10 3.11 SIRT1:n lokalisaatio sydänkudoksessä histologisten leikkeiden immunohistokemiallisella värjäyksellä 11 3.12 Sydänlihassolujen poikkipinta-alan määritys 13 4 Tulokset 13 4.1 SIRT1:n suhteellinen määrä sydänlihassoluissa 13 4.2 SIRT1:n suhteellinen määrä maksasoluissa 14 4.3 Hiirten sydänlihassolujen poikkipinta-ala (cross-sectional-area) 15 4.4 SIRT1:n lokalisaatio sydämessä 18 5 Pohdinta 21 Lähteet 27 1 1 Johdanto Lihavuuden yleistyminen ja siihen liittyvät sairaudet ovat länsimaissa kasvava ongelma (1). Erityisesti vatsaontelon sisäisen (eli viskeraalisen) rasvan määrän kasvu lisää insuliiniresistenssin, diabeteksen, dyslipidemioiden, ja kohonneen verenpaineen vaaraa (2). Lihavilla henkilöillä laihduttaminen vähentää riskitekijöitä. Elintapaohjauksen lisäksi lihavuuden hoitoon pyritään kehittämään uusia lääkkeitä ja ravitsemuksellisia hoitoja joiden tavoitteena on tyypin 2 diabeteksen sekä sydän- ja verisuonisairauksien ehkäiseminen (3). Energian saannin rajoittaminen edistää terveyttä ja pidentää elinikää (4). Sillä on suotuisia vaikutuksia sydän- ja verisuonisairauksien riskitekijöihin (5). Energiansaannin rajoittamisen ja laihtumisen vaikutuksien on todettu välittyvän ainakin osittain sirtuiini ? proteiiniperheen välityksellä (6). Tähän proteiiniperheeseen kuuluva SIRT1 toimii nisäkkäillä histonideasetylaasina ja välittää osan laihtumisen edullisista vaikutuksista. Se vaikuttaa ainakin elimistön glukoositasapainoon ja insuliinin erityksen säätelyyn sekä rasvojen metaboliaan.(7) Sydämessä kohtuullinen SIRT1:n yli-ilmentyminen näyttää suojaavan sydänlihassoluja, kun taas yli kymmenkertaisella yli-ilmenemisellä on jo haitallisia kudosvaikutuksia (8). Resveratroli on kasviperäinen polyfenoli, jota on mm. viinirypäleiden kuorissa. Se tehostaa SIRT1:n toimintaa (9). Aikaisemmissa tutkimuksissa on osoitettu että resveratrolilla on suotuisia vaikutuksia koe-eläinten terveyteen ja että osa vaikutuksista välittyy SIRT1:n kautta (10). Resveratrolin mitokondrioiden toimintaa tehostava vaikutus lisää myös koe-eläinten fyysistä suorituskykyä (10)(11). Tutkimuksen tavoitteena on selvittää runsasrasvaisen- ja vähärasvaisendieetin sekä kalorirajoituksen ja resveratrolin vaikutus SIRT1 ? proteiinin määrään hiirten sydänlihas- ja maksasoluissa. Oletuksena on että kalorirajoitus lisää kohtalaisesti SIRT1:n määrää sydänlihassoluissa ad libitum dieetteihin verrattuna. Resveratroli ei oletettavasti vaikuta SIRT1:n määrään sydänlihaksessa. Oletuksena on myös että maksassa SIRT1-proteiinin määrä vähenee kalorirajoituksen seurauksena. Myöhemmin samasta aineistosta on tarkoitus tutkia energiarajoituksen ja resveratrolin 2 vaikutuksia laajemmin myös muissa kudoksissa. Nämä vaikutukset välittyvät ainakin osittain juuri SIRT1:n kautta. 2 Tutkimusaineisto Aineisto koostuu vuoden 2007 lopulla Kuopiossa toteutetun tutkimuksen C57BI/6J uroshiirien sydämistä ja maksoista saaduista kudospaloista. Tutkimus suoritettiin Kuopion yliopiston farmakologian ja toksikologian laitoksella sekä Valtakunnallisessa koe-eläinkeskuksessa. Siinä oli mukana 100 eläintä jotka jaettiin viiteen ryhmään. Ensimmäiselle ryhmälle syötettiin runsasrasvaista (60% energiasta rasvasta, Research Diets Inc, USA) ravintorehua ad libitum (HFD= high fat diet). Toiselle ja kolmannelle ryhmälle syötettiin runsasrasvaista ravintoa ja niille annettiin rehun mukana resveratrolia 2 g/rehu kg tai 4g/rehu kg. Neljäs ryhmä sai runsasrasvaista ravintorehua ja energian saantia rajoitettiin 70 %:iin ad libitum- määrästä (CR = calory restriction). Viidennelle ryhmälle syötettiin matalarasvaista ravintorehua (10% energiasta rasvasta, Research Diet Inc, USA) ja tämä ryhmä toimi tutkimuksen kontrolliryhmänä (LFD = low fat diet). Kaikkien ryhmien päivittäisestä energiansaannista 20% tuli proteiinista. Ravinnon pääasiallinen proteiinin lähde oli kaseiini. Hiilihydraatit olivat peräisin maissitärkkelyksestä, maltodekstriinistä ja sakkaroosista. Runsasrasvaisella dieetillä ravinnossa oli 25g soijapapu öljyä ja 245g laardia. Näiden rasvojen keskimääräinen omega6/omega3 suhde on 9:1. Matalarasvaisella dieetillä ravinnossa oli 25g soijapapuöljyä ja 20g laardia. Näiden rasvojen keskimääräinen omega6/omega3 suhde on 7:1. Kokeen kesto oli 12 viikkoa, jonka aikana seurattiin tutkittavien koe-eläinten painonkehitystä, ravinnonkulutusta ja verenpainetta. Verenpaine mitattiin epäsuorasti ns. häntämittarilla. Aineenvaihdunnan erikoistutkimukset, kuten hapen kulutus, hiilidioksidin tuotanto, lämmön tuotanto, fyysinen aktiivisuus sekä ruoan ja juoman kulutus mitattiin erikoislaitteistolla (TSE LabMaster System®). Lisäksi mitattiin kerran rasvakudoksen määrä MRI-laitteella. (12) (kuva 1.) Kokeen päätteeksi hiiret lopetettiin Kuopiossa ja niiltä otettiin kudosnäytteet myöhempää analyysia varten. 3 Kuva 1. Resveratrolin on väitetty estävän koe-eläinten lihomisen dieetistä riippumatta (10). Kuopion kokeen tulokset eivät kuitenkaan tue tätä väittämää kuten kuvasta 1 käy ilmi. Tämä ei kuitenkaan sulje pois sitä ettei resveratrolilla voisi olla muita edullisia kudosvaikutuksia. Kalorirajoituksen ja rasvamäärän vaihtelu sen sijaan näkyvät selvästi eläinten painon kehityksessä. (Kuva 2.) 4 Kuva 2. Paino(%) Aika (päiviä) Kuva2. Hiirten painonkehitys. punainen = 60% rasvaa energiasta, vihreä = 60% rasvaa energiasta ja 2g/rehu kg resveratrolia, musta = 60 % rasvaa energiasta ja 4g/ rehu kg resveratrolia, violetti = kalorirajoitus 70% ad libitum määrästä, sininen = 10% rasvaa energiasta (Mira Tuunainen) 3 Menetelmät Määritin eri dieeteillä olleiden koe-eläinten sydämistä ja maksoista otetuista koepaloista SIRT1:n määrän seuraavien menetelmien avulla: Kudospalat kuljetettiin Kuopiosta Helsinkiin hiilihappojään keskellä ja Helsingissä ne säilöttiin välittömästi -80 C pakkaseen. Leikkasin veitsellä hiirten sydämistä otetut koepalat kahteen osaan. Isompi pala (3/4 alkuperäisestä) tuli proteiinien määritystä varten ja pienemmästä palasta määritetään myöhemmin tiettyjen SIRT1:n säätelemien proteiinien geenien aktiivisuus PCR menetelmällä. 3.1 Näytteiden jauhaminen ja eristys: Molemmat palat jauhettiin välittömästi erillisissä nestemäisen typen avulla viilennetyissä kulhoissa. Kulhoista jauhe ja pieni määrä nestemäistä typpeä kaadettiin Falcon putkiin. Putket merkattiin ja säilöttiin -80 C asteeseen. 5 Seuraavana päivänä jauhettuihin näytteisiin lisättiin ELISA?puskuria. Puskurin määrä arvioitiin kuhunkin näytteeseen silmämääräisesti. Näytteet sekoitettiin vortex- laitteella ja niitä seisotettiin jääkulhossa 15 minuuttia. Sen jälkeen ne siirrettiin pipetillä ennalta numeroituihin eppendorf putkiin. Putket laitettiin sentrifugiin ja niitä sentrifugoitiin kylmähuoneessa 15 minuuttia nopeudella 12000 kierrosta/min. Saatu supernatantti pipetoitiin uuteen eppendorf putkeen. Samalla varottiin koskettamasta pohjalle jäänyttä sakkaa pipetin kärjellä. Supernatantti jaettiin vielä määrästä riippuen kahteen tai kolmeen uuteen eppendorf putkeen ja otettiin 30 ul (mikrolitraa) proteiini konsentraation märitystä varten. Näytteet säilöttiin -80 C asteeseen. 3.2 Proteiinin määritys Bradfordin menetelmällä: Näytteistä piti määrittää niiden alkuperäinen proteiinikonsentraatio, jotta ne voitiin kaikki laimentaa samaan konsentraatioon (4ug/ul) Western Blot-ajoa varten. Proteiinin määritystä varten 6ul näytettä sekoitettiin 24ul:aan vettä. Tästä 1:5 laimennoksesta jaettiin 20ul neljään perättäiseen kaivoon: 2ul, 4ul, 6ul ja 8ul. Kaivoihin lisättiin vastaavasti vettä 158ul, 156ul, 154ul ja 152ul sekä 40ul Bradfordin reagenssia siten että kokonaistilavuus kussakin kaivossa oli 200ul. Standardinäytteinä oli naudan seerumin albumiinia eli BSA:ta (=bovine serum albumine), joka laimennettiin vedellä 0,1ug/ul vahvuiseksi. Standardinäytteet jaettiin kahdeksaan peräkkäiseen kaivoon siten että BSA:n määrä kasvoi: 0ul, 20ul, 40ul, 60ul, 80ul, 100ul, 120ul ja 160ul. Kaivoihin lisättiin vettä ja 40ul Bradfordin reagenssia siten että kokonaistilavuudeksi tuli 200ul. Näitä rivejä tehtiin kolme kappaletta. Nesteen pinnalla olleet kuplat puhkottiin neulalla. Kuitenkin siten että analysointi tapahtui 30 minuutin sisällä kaivojen täyttämisestä. Kerralla saatiin analysoitua 18 näytettä (ja standardi näytteet). Näytteet analysoitiin spektrofotometrillä 595nm aallonpituudella. (Kuva 3.) Näin saatiin absorbanssit puhtaalle vedelle, standardinäytteille ja varsinaisille näytteille. Puhtaan veden absorbanssi vähennettin muiden näytteiden arvoista. Standardinäytteiden absorbanssi arvojen ja tunnettujen proteiinikonsentraatioiden avulla saatiin piirrettyä käyrä josta voitiin laskea Excel-ohjelman avulla kunkin näytteen alkuperäinen proteiini pitoisuus. 6 Määritys tehtiin uudelleen jos laimennosten välinen keskihajonta oli liian suuri tai standardikäyrän pisteet eivät asettuneet riittävän tarkasti samalle suoralle. Kuva 3. Kuva 3. Esimerkki spektrofotometrillä tehdystä analyysista. Kolme vasemmanpuoleista pystyriviä ovat standardinäytteiden (BSA) absorbanssiarvoja ylhäältä alaspäin nousevana sarjana. Muilla pystyriveillä on kullakin kahden eri näytteen neljän eri laimennoksen absorbanssit. Näiden absorbanssiarvojen avulla saadaan laskettua näytteiden proteiinikonsentraatiot. 3.3 Näytteiden laimentaminen (4ug/ul): Alkuperäisten proteiinipitoisuuksien avulla laskettiin kuinka paljon näytettä ja vettä täytyy sekoittaa, jotta saadaan 100ul liuosta jossa on proteiinia 4ug/ul. Näytteet ja vesi pipetoitiin eppendorf putkeen ja sekoitettiin vortex-laitteella. Tämän jälkeen näyte jaettiin 15ul:n eriin eppendorf putkiin. Toiset näytteet pidettiin työn aikana jäämurskan seassa. Työn päätyttyä näytteet säilöttiin -80 C asteeseen. Joidenkin näytteiden kokonaismäärä oli niin pieni että ne laimennettin kokonaan (4ug/ul). Suurimmasta osasta jäi kuitenkin säilöön (-80 C asteeseen) laimentamatonta näytettä myöhempiä analyyseja varten. 7 3.4 Näytteiden keittäminen: Näytteet keitettiin ennen proteiinien erottelua Western Blotissa. Keittämisen tarkoituksena on denaturoida proteiinit, jolloin niiden kolmiulotteinen rakenne muuttuu ja vasta-aine sitoutuu niihin paremmin. 5ul näytettä (4ug/ul) eli 20ug proteiinia sekoitettiin 5ul:aan ELISA-puskuria ja 10ul:aan LSB:ta. LSB:n sinisen värin avulla näytteiden paikka oli myöhemmin helppo paikantaa ajon aikana geelistä. Näytteet sekoitettiin vortex-laitteella ja pienellä sentrifugilla ?spinnaamalla?, jonka jälkeen niitä keitettiin 100 asteessa viisi minuuttia. Keittämisen jälkeen näytteet laitettiin jäihin, ?spinnattiin? uudelleen ja laitettiin kaikkien näytteiden valmistuttua - 20 C asteeseen. Muita näytteitä säilytettiin jäiden seassa työn aikana. 3.5 Proteiinien erottelu Western Blot-menetelmällä: Ensin valmistettiin geelit, joissa näytteet ajettiin. Geeli valmistettiin vetokaapissa, koska akryyliamidi on karsinogeeninen aine. Alageelin valmistus: H2O 10,65ml, Tris 3M 2,25ml, Aa-BisA (akryyliamidia) 4,8ml, SDS 10% 180ul, APS 10% 90ul ja Temed 6ul. Neste pipetoitiin sitä varten koottujen lasien väliin (SDS PAGE) ja sen annettiin jähmettyä 25 minuuttia. Pinnalle pipetoitiin 200ul vettä jähmettymisen ajaksi. Vesi kaadettiin pois ennen ylägeelin pipetointia. Ylägeelin valmistus: H2O 2,95ml, Tris 1M 500ul, Aa-BisA (akryyliamidia) 500ul, SDS 10% 40ul, APS 10% 24ul ja Temed 3ul. Neste pipetoitiin jähmettyneen alageelin päälle ja siihen asetettiin 20 hakainen kampa kaivojen muodostamiseksi. Geelin annettiin jähmettyä 20 minuuttia. Geelit varastoitiin vedellä kostutettuihin talouspapereihin käärittyinä kylmähuoneeseen (+4C) jos ajoa ei suoritettu samana päivänä. Näytteiden ajaminen suoritettiin SDS PAGE laitteistolla jossa käytettiin ajopuskurina noin neljää litraa Laemmli-ajopuskuria: Tris-HCl 25mM ja glysiini 192mM. Laitteisto koottiin ja kuhunkin kaivoon pipetoitiin 20 ul näytettä. Saman ryhmän näytteet pipetoitiin peräkkäisiin kaivoihin. Näytteitä ajettiin ensin 30 minuuttia 100V jännitteellä, jonka jälkeen jännite nostettiin 110V:iin noin kahdeksi ja puoleksi 8 tunniksi. Ajopuskurin ollessa lämmintä laitteistoon kytkettiin kiertävä kylmä vesi jäähdyttämään laitteistoa ja ajopuskuria. Ajo lopetettin aiemmin mikäli näytteet olivat ajautuneet lähelle geelin alareunaa. Maksanäytteet ajautuivat nopeammin, joten ajamiseen riitti 2 tuntia 10 minuuttia. Tällä tavoin saatiin ajettua kerralla 18 näytettä. Lisäksi kaikissa ajoissa oli mukana sama kontrollinäyte kaivossa numero 19. Sydännäytteitä ajettaessa kontrollinäytteenä käytettiin hiirtä numero 79 (putken numero 33). Maksanäytteitä ajettaessa kontrollinäytteenä oli hiiri numero 62 (putken numero 32). Markkeri (eli vertailu näyte) oli kaivossa numero 20. Sen avulla saatiin standardi viivat joiden molekyylipainot tunnettiin. Näiden viivojen avulla arvioitiin myöhemmin työn edetessä että millä kohdalla SIRT1?proteiineihin (molekyylipaino n110kDa) sitoutuneiden vasta-aineiden muodostama viiva sijaitsee membraanilla. 3.6 Proteiinien blottaus membraanille: Ajamisen jälkeen proteiinit siirrettiin geeliltä membraanille. Blottaus -laitteiston pohja kasteltiin tislatulla vedellä. Tämän jälkeen asetettiin tarvikkeet seuraavassa järjestyksessä; muovinen kelmu, kaksi suodatinpaperia (joita oli uitettu 5-30 minuuttia WB-puskurissa; Tris-HCl 25mM, glysiiniä 150mM ja MetOH 10% ), kaksi PVDF- membraania (joita oli uitettu 1 minuutti metanolissa ja 1-10 minuuttia WB- puskurissa)). PVDF-membraanien reunoihin leikattiin pienet lovet (toiseen yksi ja toiseen kaksi). Näin membraanit oli myöhemmin helppo erottaa toisistaan ja tiedettiin miten päin näytteet olivat. Geeli asetettiin PVDF:n päälle siten että geelin yläpuoli tuli leikatun reunan puolelle. Geelin päälle kaadettiin hieman WB-puskuria ja päälle asetettiin kaksi suodatinpaperia. Pientä telaa käyttäen rullattiin kuplat pois geelin ja membraanien välistä. Kansi suljettiin ja näytteitä blotattiin 190mA sähkövirralla kaksi tuntia. Sähkövirran avulla proteiinit siirtyivät geeliltä membraanille. 3.7 Blokkaus: Blokkauksen tarkoituksena on saada näytteet erottumaan paremmin taustastaan. Blokkausta (ja myöhempiä työvaiheita) varten valmistettiin 5% -maito-TBS-liuos: 12,5g maitojauhetta ja 250ml TBS:a. Maitojauhe punnittiin digitaalivaa´alla. Aineita sekoitettiin 30 minuuttia ennen blokkausta. Lisäksi maitojauhe oli koko työpäivän ajan magneettisekoittimessa. 9 Blottauksen valmistuttua laitteisto purettiin ja PVDF-membraanit laitettiin huoneenlämmössä inkuboitumaan kahdeksi tunniksi sekoituslaitteeseen 50ml:aan 5% -maito-TBS-Tween liuosta. 3.8 Vasta-aineiden kiinnittäminen: Blokkauksen jälkeen membraanit siirrettiin inkuboitumaan yöksi kylmähuoneeseen(+4C) sekoituslaiteeseen, jossa oli ensimmäinen vasta-aine (SIRT1) liuos: 25ml 5%-maito-TBS-0,05% Tween nestettä ja 12,5ul anti-SIRT1 (=anti-SIR2) vasta-ainetta. 5%-maito-TBS-Tween-liuos laitettiin yöksi jääkaappiin (+8C) ja nostettiin seuraavana aamuna ennen muiden töiden aloittamista takaisin huoneenlämpöön lämpenemään. Ennen toisen vasta-aine-liuoksen valmistusta 50ml 5%-maito-TBS- Tween-liuosta lämmitettiin huoneenlämpöiseksi vesihauteessa. Seuraavana aamuna membraanit huuhdeltiin TBS-0,05% Tween-liuoksella ja niitä pestiin kolme kertaa viisi minuuttia samassa liuoksessa sekoituslaitteella. Liuos vaihdettiin aina uuteen pesujen välillä. Tämän jälkeen membraaneja inkuboitiin kaksi tuntia vasta-aineessa numero kaksi (anti-rabbit): 5ul anti-rabbit vasta-ainetta ja 25ml 5%-maito-TBS-0,05% Tween nestettä. Kahden tunnin kuluttua membraanit huuhdeltiin TBS-0,05% Tween-liuoksella. Ne pestiin kolme kertaa viisi minuuttia samassa liuoksessa sekoituslaitteella. Liuos vaihdettiin aina uuteen pesujen välillä. Lopuksi membraaneja pestiin vielä TBS- liuoksessa 10 minuutin ajan, jonka jälkeen ne kuivattiin suodatinpapereilla ja laitettiin piirtoheitinkalvon puolikkaan päälle. Membraanien päälle pipetoitiin 2,4ml ECL Plus reagenssia. Niitä inkuboitiin viisi minuuttia, jonka jälkeen ne nostettiin suodatinpaperin päälle ja kuivattiin kevyesti painaen suodatinpaperin paloilla. Piirtoheitinkalvo kuivattiin käsipyyhkeillä jonka ja membraanit nostettiin takaisin piirtoheitinkalvolle. Päälle asetettiin toinen samankokoinen piirtoheitinkalvon puolikas. 10 3.9 Viivojen lukeminen membraanilta: Membraanien viivat (bandit) oli tarkoitus analysoida ECL Plus reagenssin avulla kemiluminosenssin havaitsevalla Typhoon skannerilla. Typhoon oli kuitenkin rikki. Yhtä ajoa lukuunottamatta kaikki näytteet analysoitiinkin densitometrin avulla filmeiltä. Membraanien viivat siirrettiin filmille pimiössä. Piirtoheitinkalvon välissä olevat membraanit laitettiin kasetin sisälle yhdessä filmin kanssa ja annettiin olla siellä viidestä sekunnista kymmeneen minuuttiin. Sopiva valotusaika löytyi kokeilemalla. ECL Plus reagenssi reagoi kakkosvasta-aineen kanssa ja sen seurauksena syntynyt fluoresoiva säteily sai aikaan filmillä näkyneet viivat. Mitä enemmän näytteessä oli SIRT1-proteiinia, sitä enemmän siihen sitoutui ensimmäistä vasta-ainetta ja siten myös kakkosvasta-ainetta. Tällöin myös ECL Plus reagenssin aikaan saama fluoresoiva säteily oli voimakkaampaa. Kasetin sisältä filmi upotettiin kehitysliemeen puoleksi minuutiksi ja kiinnitysliemeen 2-5 minuutiksi. Lopuksi filmi huuhdeltiin vesijohto vedessä ja jätettiin kuivumaan muutamaksi tunniksi. 3.10 Tulosten käsittely tietokoneella: Filmi kuvattiin densitometrilla Genesnap ohjelman avulla ja viivojen tummuus (eli tiheys) arvioitiin Gene Tools-ohjelmalla. Saadut tiheysarvot siirrettiin Excel- ohjelmaan, jossa niitä verrattiin kontrollinäytteen tiheyteen. Excelistä arvot siirrettiin Prism?ohjelmaan, jonka avulla lopulliset analyysit ja pylväsdiagrammit tehtiin. Näin voitiin lopulta vertailla SIRT1 proteiinin määrää eri dieeteillä olleiden hiirten sydämistä ja maksoista. 11 3.11 SIRT1:n lokalisaatio sydänkudoksessä histologisten leikkeiden immunohistokemiallisella värjäyksellä: SIRT-1:n lokalisaatiota sydänkudoksessa tarkasteltiin alkuperäisistä kudosnäytteistä tehtyjen histologisten leikkeiden immunohistokemiallisen värjäyksen avulla. Tarkoituksena oli osoittaa SIRT1:n pääasiallinen sijainti sydänlihassolujen sisällä. Parafiiniin valettuja leikkeitä laitettiin 15kpl lasikelkassa lämpökaappiin +60 asteeseen 15 minuutiksi. Näin parafiini saatiin pehmenemään. Tämän jälkeen näytteitä uitettiin parafiinin poistamiseksi laskevassa alkoholisarjassa seuraavasti: xyleenissä 5min x 3, absoluuttisessa etanolialkoholissa (Aa) 5min x 2, 96% etanolialkoholissa (A) 5min x 2, 70% etanolialkoholissa 5min ja huuhdeltiin vedessä. Nesteet olivat lasiastioissa vetokaapissa. Vaihdettaessa astiasta toiseen kelkasta valutettiin pois ylimääräiset nesteet. Vesihuuhtelun jälkeen lasit siirrettin värjäyskelkkaan ja muoviseen astiaan, jonne kaadettiin 250ml 0.01M sitraattipuskuria pH 6.0 (: 1,05g sitruunahappoa + ad 500ml H20). pH:n säädettiin pH-mittarin avulla NaOH:lla. Sitraattipuskurin avulla saatiin solukalvot auki. Muoviastia laitettiin mikroaaltouuniin ja laseja keitettiin 4 x 5,5min. Ennen kolmatta ja neljättä kierrosta astiaan lisättiin 75ml sitraattipuskuria haihtuneen tilalle. Keittämsen jälkeen lasien annettiin jäähtyä puskurissa 20min- 2 tuntia. Jäähtyneet lasit laitettiin pystymaljaan, jossa ne pestiin 3 x 5min TBS-liuoksessa(: Trizma-HCl 30.30g, Trizma Base 6.95g, NaCl 43.83g ja ad 5.0 litraa H2O:ta). pH säädettiin pH-mittarilla HCl:n avulla välille 7,6 -7,8. Pesujen jälkeen suoritettiin endogeenisen peroksidaasin blokkaus. Pystyamaljaan mitattiin 60ml metanolia ja pipetoitiin 960ul vetypeoksidia (/ H2O2:a). Laseja inkuboitiin liuoksessa 30min. Tämän jälkeen lasit pestiin TBS-liuoksessa 3 x 10min. 12 Viimeisen pesun jälkeen lasit kuivattiin reunoilta näytteitä varoen. Näytteiden ympärille piirrettiin PapPen ?rasvakynällä rajat. Näin pipetoidut nesteet pysyivät paremmin halutussa kohdassa. Lasit asetettiin kosteaan kammioon ja niiden päälle pipetoitiin 100ul ?10%NS with 1% BSA in TBS? -blokkausliuosta(: 1000ul vuohen normaaliseerumia, 0,1g BSA ja ad 10ml TBS pH 7.6-7.8). Inkubaatioaika blokkausliuoksessa oli yksi tunti. Kostea kammio koostui vedellä kostutetusta vaahtomuovista, joka oli asetettu matalaan muoviseen astiaan (eli kammioon). Blokkausliuos poistettiin kopauttamalla lasin reunaa pöydällä olevaan paperiin. Kullakin lasilla oli kaksi näytettä samasta hiirestä. Toisen näytteen päälle pipetoitiin 80ul 1. vasta-ainetta eli Anti-SIR2:ta (1:100 laimennoksella; 1485ul TBS-with-1%- BSA ja 15ul Anti-SIR2). Lasilla oleva toinen näyte toimi negatiivisena kontrollinäytteenä. Sen päälle pipetoitoitiin 80ul pelkkää 1. vasta-aineen laimennosliuosta (TBS-with-1%-BSA). Laseja inkuboitiin kylmähuoneessa +4C:ssa yön yli. Seuraavana päivänä lasit nostettiin huoneenlämpöön ja ne pestiin 3 x 10 minuuttia TBS-liuoksessa. Tämän jälkeen niiden päälle pipetoitiin 100ul 2. vasta-ainetta eli Biotinylated Anti-Rabbit IgG:ta (1:250 laimennoksella; 2988ul TBS-with-0.5%BSA ja 12ul Biotinylated Anti-Rabbit IgG). Laseja inkuboitiin 30 minuuttia jonka jälkeen ne pestiin 3 x 10 minuuttia TBS-liuoksessa. Pesujen jälkeen näytteiden päälle laitettiin 2-3 tippaa avidiinia (R.T.U. Vectastain Kit). Avidiini sitoutuu 2.vasta-aineissa olevaan biotiiniin ja sitoo myös myöhemmin lisättävän väriaineen. Näytteitä inkuboitiin 30 minuuttia, jonka jälkeen ne pestiin 3 x 10 minuuttia TBS-liuoksessa. Seuraavaksi näytteet värjättiin. AEC eli 3-amino-9-etyylikarbatsoli on myrkyllistä, joten sitä käsiteltäessä käytettiin hanskojen lisäksi myös suojamaskia. Aine punnittiin analyysivaa´alla. AEC-värjäysliuos valmistettiin juuri ennen värjäystä lasiastioissa ja lasipipeteillä: 4.50ml 0.2M etikkahappoa (acetic acid), 10.60ml 0.2M Na-asetaattia ja ad 60ml H2O, 12mg 3-amino-9-etyylikarbatsolia, 3.6ml N.N-dimetyyliformamidia ja 60ul vetyperoksidia (H2O2). Liuos kaadettiin TBS:n tilalle pystymaljaan ja laseja inkuboitiin pimeässä 10 minuuttia. Tämän jälkeen AEC-liuos kaadettiin dekkaan ja 13 laseja pestiin 3 x 5 minuuttia TBS-liuoksessa. AEC on ympäristömyrkky joten se säilöttiin myöhempää hävittämistä varten. Viimeisen TBS-pesun jälkeen pystymalja asetettiin juoksevan kraanaveden alle viideksi minuutiksi. Tämän jälkeen lasit nostettiin pöydälle kuivumaan. Kun lasit olivat kuivia, niin niiden päälle laitettiin kaksi tippaa mounttaus-liuosta ja ohut läpinäkyvä 24mm x 24mm kokoinen peitinlevy. Kuhunkin lasiin merkittiin näytteen ryhmä. Näytteet käytiin läpi mikroskoopilla. Jokaisesta ryhmästä otettiin yksi edustava kuva Leica QWin ?ohjelman avulla 400-kertaisella suurennoksella. Kuvia vertaamalla näkee että joissakin ryhmissä tumat ovat voimakkaammin värjäytyneitä kuin toisissa, eli SIRT1:n määrä vaihtelee eri ryhmien välillä. 3.12 Sydänlihassolujen poikkipinta-alan määritys: Sydänlihassolujen poikkipinta-ala määritettiin HE-värjättyistä paraffiinileikkeistä. Leikkeet värjättiin Biomedicumissa Anatomian laitoksella. Värjätyt leikkeet käytiin läpi mikroskoopilla. Kuvat ja rajaukset suoritettiin Leica QWin ? ohjelman avulla. Jokaisesta näytteestä otettiin 400-kertaisella suurennoksella 5-15 näkökenttää, joista ympyröitiin kaikki poikittain leikkautuneet pyöreät sydänlihassolut, joissa tuma oli keskellä ja solun rajat erotettavissa. Näkökentät otettiin ainoastaan vasemman kammion ympäriltä. Näytteiden laatu vaihteli leikkaustekniikasta johtuen. Tämän takia kelvollisten solujen määrä näytettä kohden vaihteli jonkin verran. 4 Tulokset 4.1 SIRT1:n suhteellinen määrä sydänlihassoluissa: 14 SIRT1:n suhteellinen määrä sydänlihassoluissa oli suurempi energiarajoitetuilla hiirillä, kuin runsasrasvaista dieettiä noudattaneilla hiirillä. Ero oli tilastollisesti merkitsevä verrattaessa energianrajoitus ryhmää (ryhmä 4) ja kaikkia 60% rasvaa energiasta syöneitä ryhmiä (ryhmät 1, 2 ja 3) yhdessä. (kuva 4.) Samoin saatiin tilastollisesti merkitsevä ero verrattaessa 4. ryhmää ja 4g/kg resveratrolia (ryhmä 3) saanutta ryhmää. (kuva 5.) Resveratrolia saaneilla hiirillä (ryhmät 2 ja 3) oli vähemmän SIRT1-proteiinia kuin muutoin samalla dieetillä olleilla hiirillä (ryhmä 1). Erot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä. SIRT1:n suhteellinen määrä oli pienempi myös ryhmillä 1. ja 2. verrattuna 4. ryhmään. Näiden ero ei kuitenkaan ollut tilastollisesti merkitsevä. Energiarajoitettujen hiirten SIRT1:n määrä oli lisääntynyt myös verrattuna 10% rasvaa energiasta syöneeseen ryhmään. Ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä. 15 Kuva 4. Energiarajoitus lisäsi SIRT1:n määrää hiirten sydämissä verrattuna runsaasti rasvaa sisältäneeseen ad libitum ruokavalioon. Kuva 5. 60% rasvaa syöneiden ryhmien (ryhmät 1, 2 ja 3) välillä oli pieniä, joskaan ei tilastollisesti merkitseviä eroja SIRT1:n määrässä. 4g/kg resveratrolia saaneilla hiirillä (ryhmä 3) oli kaikkein vähiten SIRT1 ? proteiinia. Myös 2g/kg resveratrolia saaneen ryhmän (ryhmä2) hiirillä oli hieman vähemmän SIRT1:a kuin 1 ryhmällä. 4.2 SIRT1:n suhteellinen määrä maksasoluissa: 16 SIRT1:n suhteellinen määrä maksasoluissa oli suurempi energiarajoitetuilla hiirillä, kuin runsasrasvaista dieettiä noudattaneilla hiirillä. Ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Vähärasvaista ravintoa saaneilla hiirillä (ryhmä 5) oli enemmän SIRT1 ? proteiinia maksassa kuin runsasrasvaista ravintoa saaneilla hiirillä (ryhmät 1, 2 ja 3). Ero oli tilastollisesti merkitsevä. (Kuva 6.) Kuva 6. Resveratroli ei vaikuttanut merkittävästi SIRT1 ?proteiinin määrään maksassa. 2g/kg resveratrolia saaneilla hiirillä oli jonkin verran enemmän SIRT1:ä maksassa kuin kahdella muulla 60% rasvaa syöneistä ryhmistä (ryhmät 1 ja 3). Ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä. (Kuva 7.) 17 Kuva 7. 4.3 Hiirten sydänlihassolujen poikkipinta-ala (cross-sectional-area): Runsasrasvaista ravintoa syöneiden hiirien (ryhmä1) sydänlihassolujen keskimääräinen poikkipinta-ala oli noin 314 cm2. Samaa ravintoa ja 2g/kg resveratrolia saaneilla hiirillä poikkipinta-ala oli 280 cm2 ja 4g/kg resveratrolia 276 cm2. Kalorirajoitetuilla hiirillä vastaava arvo oli 256cm2 ja 10% rasvaa syöneellä ryhmällä 267 cm2. Kalorirajoitetuilla ja vähärasvaista ruokaa syöneillä hiirillä oli keskimäärin pienemmät sydänlihassolut kuin runsasrasvaista ruokaa syöneillä lajitovereilla. Ryhmien 1 ja 4 sekä 1 ja 5 väliset erot olivat tilastollisesti merkitseviä. (Kuva 8.) Resveratrolia saaneilla hiirillä sydänlihassolut olivat jonkin verran pienempiä runsasrasvaista ravintoa syöneeseen ryhmään verrattuna. Erot eivät kuitenkaan olleet tilastollisesti merkitseviä. 18 Kuva 8. 4.4 SIRT1:n lokalisaatio sydämessä: Kalorirajoitus lisää SIRT1:n määrää hiirten sydämissä kuten jo aiemmin todettiin. Tämä näkyy myös histokemiallisissa värjäyksissä. Samoin 10% rasvaa syöneillä hiirillä näkyy jonkin verran enemmän SIRT1 ? proteiinia. Kuvista näkee myös että SIRT1 lokalisoituu pääasiassa tumaan. (Kuvat 9, 10, 11, 12 ja 13). 19 Kuva 9. 60% rasvaa syöneet hiiret (ryhmä 1) Kuva 10. 60% rasvaa +2g/kg resveratrolia syöneet hiiret (ryhmä 2) 20 Kuva 11. 60% rasvaa +4g/kg resveratrolia syöneet hiiret (ryhmä 3) Kuva 12. Kalorirajoitus (Ryhmä 4). Kuvassa hieman artefaktaa (mustat viirut). 21 Kuva 13. 10% rasvaa syöneet hiiret (ryhmä 5) 5 Pohdinta Nykyihminen on lajina ollut olemassa n. 200 000 vuotta. 10 000 vuotta sitten tapahtunut maatalouden vallankumous ja myöhemmin 1700-luvun puolessa välissä alkanut teollinen vallankumous ovat muuttaneet merkittävästi sekä ihmisten ruokavaliota että fyysisen aktiivisuuden määrää. Ihmiselimistö ei kuitenkaan ole ennättänyt sopeutua näihin lajinkehityksen näkökulmasta vasta äskettäin tapahtuneisiin radikaaleihin muutoksiin. Elimistö varastoi ylimääräisen energian pääosin rasvana. Rasvakudoksen ylimäärää kutsutaan lihavuudeksi (2). Lihavuuden ja siihen kiinteästi liittyvien elintapasairauksien yleistyminen onkin kovaa vauhtia kasvava ongelma Suomessa ja muissa länsimaissa (1). Erityisesti viskeraalisen rasvan määrän kasvu on yhteydessä sydän- ja verisuonisairauksien vaaratekijöihin(2). Veren korkea triglyseridipitoisuus on yhteydessä viskeraalisen rasvan kertymiseen. Länsimaiseen kulttuuriin kuuluvat alkoholi ja ravinnon korkea glykeeminen kuorma puolestaan nostavat veren triglyseridipitoisuutta (24). 22 Lihavuuteen liitettyjä sairauksia ovat mm. tyypin 2 diabetes, kohonnut verenpaine, metabolinen oireyhtymä, sepelvaltimotauti, aivoinfarkti ja aivoverenvuoto, obstruktiivinen uniapnea, kihti, sappikivet, rasvamaksa, polvien nivelrikko, astma sekä eräät syöpämuodot; rintasyöpä, (menopaussin jälkeen), kohdunrungon syöpä paksusuolen syöpä ja munuaissyöpä (2). Näihin sairauksiin liittyy jo alkuvaiheessa useita haitallisia kohde-elin ja ? kudos muutoksia. Näihin muutoksiin johtavien mekanismien tutkiminen on tärkeää, koska se mahdollistaa tulosten hyödyntämisen lihavuuden ja sen liitännäissairauksien hoidossa. Hyvänä esimerkkinä voidaan pitää reniini-angiotensiini-aldosteroni?järjestelmään vaikuttavia lääkkeitä; ACE-estäjiä, sartaaneja ja uusimpana tulokkaana reniininestäjä aliskireeniä. Lihavuus aiheuttaa muutoksia reniini-angiotensiini-aldosteroni- järjestelmän ja autonomisen hermoston toiminnassa. Nämä muutokset edistävät osaltaan verenpaineen kohoamista.. Korkea verenpaine puolestaan nopeuttaa sydämen vajaatoiminnan kehittymistä. (19) ACE- estäjät ja sartaanit laskevat verenpainetta, vähentävät haitallisten kudosmuutosten kehittymistä ja vähentävät sitä kautta sepelvaltimotapahtumia, aivohalvauksia sekä sydän- ja verisuonitautikuolemia. (20) Aliskireenin vaikutus päätetapahtumiin on oletettavasti samankaltainen. Tarvitaan kuitenkin pidempiaikaisia seurantatutkimuksia koska se on vasta äskettäin tullut käyttöön. (21) Näiden lääkkeiden edullinen vaikutus välittyy ainakin verenpaineen laskun sekä suorien aldosteronin ja angiotensiini II:n aiheuttamien kudosmuutosten estymisen kautta (25). Lihavuuteen liittyen myös sydämessä tapahtuu useita haitallisia muutoksia. Termi cor adiposum (englanniksi fatty heart) tarkoittaa rasvan kertymistä sydänlihassoluihin ja siitä johtuvaa sydänlihassolujen degeneraatiota.. Synnynnäisesti lihavilla diabeettisilla (ZDF= Zucker diabetic fatty) rotilla kuvattu lipotoksinen kardiomyopatia muistuttaa läheisesti cor adiposumia. Lihavilla adiposyytit eli rasvasolut täyttyvät triglyserideillä ja tämän seurauksena plasman vapaiden rasvahappojen pitoisuus kasvaa. Tällöin rasvaa kertyy adiposyyttien lisäksi myös muihin soluihin (ns. ektooppinen rasva). Ektooppista rasvaa kertyy mm. haimaan, maksaan ja sydämeen. On osoitettu että kehon painoindeksi korreloi sydänlihassolujen rasvamäärään. Sydänlihassoluihin kertyy rasvaa jo ennen muita lihavuuden aiheuttamia komplikaatioita. Ektooppisen rasvan kertyminen kiihtyy glukoosiaineenvaihdunnan ja diabeteksen kehittymisen myötä ja johtaa vasemman kammion hypertrofiaan, systoliseen vajaatoimintaan ja heikentyneeseen diastoliseen täyttymiseen. (17) 23 Lihavuus muuttaa myös sydänlihaksen energia-aineenvaihduntaa. Plasman vapaiden rasvahappojen pitoisuuden kasvaessa kasvaa myös niiden sisäänotto sydänlihassoluihin. Samalla niitä myös hapetetaan enemmän energiaksi. Myös rasvakudoksesta vapautuvien adipokiinien; leptiinin ja adiponectiinin pitoisuudet verenkierrossa kasvavat. Adipokiinit ovatkin osoittautuneet tärkeiksi sydämen energia-aineenvaihdunnan ja insuliinivälitteisen signaloinnin säätelijöiksi. (19) Lihavuuteen liittyvään insuliiniresistenssiin liittyy usein pieni LDL -partikkeli koko ja korkeat triglyseridi (TGA) -pitoisuudet. Nämä ovat puolestaan yhteydessä sepelvaltimoiden ahtautumiseen (eli ateroskleroosiin) ja siihen liittyvään inflammaatioon sekä endoteelin dysfunktioon. Sepelvaltimoiden ahtautuminen saattaa jo itsessään aiheuttaa kohdekudoksen iskemiaa. Inflammaatio puolestaan altistaa seinämien plakit repeämiselle ja sen kautta tukkeavan hyytymän muodostumiselle. Mikäli suoni tukkeutuu täysin, on seurauksena sydäninfarkti ja kohdekudoksen solujen kuolema joko nekroottisesti tai apoptoosin kautta. (16) Sydänlihaksen rajallisen uusiutumiskyvyn takia olisi tärkeää ennaltaehkäistä näiden vaurioiden syntyä. Lipotoksisuus puolestaan tarkoittaa korkean TGA ? pitoisuuden ja vapaiden rasvahappojen aiheuttamaa toksista vaikutusta, joka tässä tapauksessa aiheuttaa suoraan sydänlihassolujen lisääntyneen apoptoosin. Suuret määrät vapaita rasvahappoja lisäävät oksidatiivista stressiä ja vähentävät sepelvaltimoita laajentavan NO:n tuottoa. (16) Lihavilla henkilöillä plasmassa on jatkuvasti ylimäärin rasvahappoja. Rasvavarastoista purettavat ja ravinnosta tulevat pitkäketjuiset rasvahapot (ja keramidi) aiheuttavat jatkuvasti koholla ollessaan insuliiniresistenssiä ja estävät siten insuliinin anti-apoptoottisia vaikutuksia. Jatkuva sydänlihassolujen apoptoosi heikentää sydämen toimintaa, koska sydänlihaksen uusiutumiskyky on rajoittunut. (17) SIRT1:n aktivaatio (esimerkiksi kalorirajoituksen avulla) puolestaan estää solujen apoptoosia. On osoitettu että sydämessä on myös sydänkantasoluja. Ne eivät kulkeudu vaurioalueelle, mutta vastaavat kasvutekijöihin; e.g. IGF-1:n vaikutuksesta selviytyminen iskeemisessä ympäristössä paranee. (18) Näinollen SIRT1:n aktivoiminen voisi insuliiniherkkyyden paranemisen myötä johtaa myös sydänlihassolujen vähentyneeseen apoptoosiin. Toisaalta resveratroli vähentää ainakin hiirillä IGF-1:n pitoisuutta. (11) 24 Muita lihavuuteen liittyviä ateroskleroosin kehittymiseen vaikuttavia riskitekijöitä ovat: pieni HDL- pitoisuus, apo B/apo A1 -suhde, korkea paasto-glukoosi, korkea paasto-insuliini ja veren hyytymisjärjestelmän häiriöt (pro-tromboottinen tila). Myös HDL ?partikkeleiden koostumuksella on merkitystä. Jatkuvasti koholla oleva veren glukoosi- tai fosfolipidi?pitoisuus kiihdyttää AGE:n (advanced glycation end products) muodostumista ja siten ateroskleroosia. AGE:t sitovat makromolekyylejä toisiinsa ja siten jäykistävät suonten seinämiä. (16) Korkea verensokeri myös heikentää endoteelin toimintaa häiritsemällä endoteelin kantasolujen (progenitorcells) toimintaa. Tämä vaikutus välittyy mahdollisesti SIRT1:n määrän vähenemisen kautta. (29) Viime vuosina kertyneiden tutkimustulokset osoittavat että kalorirajoitus pidentää useiden eri eläinlajien elinikää (13). Samoin on osoitettu että NAD+-riippuvaiset deasetylaasit; Sir2-proteiinit (sirtuiinit) osallistuvat kiinteästi tähän säätelyprosessiin ainakin yksinkertaisemmissa eliöissä. Nisäkkäillä on tunnistettu 7 sirtuiinia; SIRT1-7. Kalorirajoitus lisää SIRT1 proteiinin määrää rasvakudoksessa, aivoissa, maksassa ja munuaisissa, kun taas liiallinen energiansaanti vähentää sen määrää (14). SIRT1 deasetyloi histoneita ja useita solujen stressin sietoa parantavia ja anti-apoptoottisia proteiineja; p53, Ku70, Nf-kB ja FOXO-proteiinit (15). Osa näitä proteiineja säätelevistä geeneistä (mm. p53) on usein mutatoitunut myös kasvaimissa, joten SIRT1:n liiallisella aktivoimisella voi olla myös kääntöpuolensa. On myös osoitettu että joissain tapauksissa sirtuiinit lyhentävät elinikää. Hiivoilla Sir2 lyhensi kronologista elinikää kalorirajoituksen aikana. On epäselvää kumpi on tärkeämpää ihmisen kannalta; vaikutus kronologiseen vai replikatiiviseen elinaikaan. (27) Osa SIRT1:n vaikutuksista välittyy PPAR?:n ja PGC-1?:n kautta. Nämä tumareseptorit ovat tärkeitä mm. lihassolujen erilaistumisessa, rasvasolujen muodostumisessa, rasvan varastoinnissa ja maksan metaboliassa. (26) SIRT1 osallistuu myös sydämessä tapahtuvien kudosmuutosten säätelyyn. Sydämessä kohtuullinen SIRT1:n yli-ilmentyminen näyttää suojaavan sydänlihassoluja, kun taas yli kymmenkertaisella yli-ilmenemisellä on jo haitallisia kudosvaikutuksia. SIRT1 on sydänlihassolujen sisäinen säätelijä, joka estää sydänlihassolujen apoptoosia ja 25 aiheuttaa lievää hypertrofiaa. Edulliset vaikutukset tulevat esille koe-eläimissä kun niiden energiansaantia rajoitetaan. (8) Sydänlihaksen liiallinen hypertrofia itsessään johtaa kuitenkin ennen pitkään sydämen pumppaustehon huononemiseen ja sydämen vajaatoimintaan. Tässä tutkimuksessa SIRT1:n määrä sydänlihassoluissa oli suurempi kalorirajoitetuilla hiirillä kuin runsasrasvaista ravintoa ad libitum saaneilla lajitovereilla. Lisäksi sydänlihassolut olivat pienempiä. Sama vaikutus näkyi myös ravinnon rasvamäärää rajoitettaessa, joskin heikommin. Resveratrolia saaneilla hiirillä SIRT1:ä oli vähemmän ja sydänlihassolut eivät olleet niin pahasti hypertrofioituneet kuin verrokeilla. Resveratrolilla saattaa siis olla sydänlihasta suojaava vaikutus vaikka tilastollisia eroja sydänlihassolujen koon vaihteluun ei tässä tutkimuksessa tullutkaan esille. SIRT1:n aktivaatio resveratrolin avulla ei siis näyttäisi johtavan sydänlihassoluja suojaavaan lievään hypertrofiaan. Tulos voi tosin selittyä sillä että resveratroli aktivoi SIRT1:ä, jolloin negatiivisen palautevaikutuksen takia SIRT1:n kokonaismäärä jää pienemmäksi ja tällöin myös sydänlihassolujen hypertrofia estyy. 60% rasvaa syöneiden ryhmien (ryhmät 1,2 ja 3) välillä oli pieniä, joskaan ei tilastollisesti merkitseviä eroja SIRT1:n määrässä. 4g/kg resveratrolia saaneilla hiirillä (ryhmä 3) oli vähemmän SIRT1 ? proteiinia kuin kahdella muulla ryhmällä. Myös 2g/kg resveratrolia saaneen ryhmän (ryhmä2) hiirillä oli hieman vähemmän SIRT1:a kuin 1 ryhmällä. Kuten jo edellä todettiin, on mahdollista että SIRT1:n aktiivisuuden kasvaessa elimistö vähentää sen määrää negatiivisen palaute silmukan (negative feedback) avulla. Jatkossa olisi hyvä tutkia vielä SIRT1:n säätelemien proteiinien (p53, Ku70, Nf-kB ja FOXO-proteiinit sekä PPAR? ja PGC-1?) määrää ja aktiivisuutta samoista näytteistä sekä määrittää SIRT1:n pitoisuus samojen hiirien muissa kudoksissa. Näin niitä voitaisiin verrata aiempiin tutkimustuloksiin. Samoista näytteistä voidaan vielä myös analysoida SIRT1:a aktivoivan yhdisteen resveratrolin vaikutus SIRT1:n säätelemien proteiinien määriin ja aktiivisuuksiin. Näiden tulosten avulla voisi olla mahdollista tunnistaa haitallisiin kudosvaurioihin johtavia metabolisia reittejä ja kehittää niiden pohjalta uusia ravitsemus ja lääkehoitoja näiden vaurioiden ehkäisemiseksi. 26 Myöhemmin tulee myös selvittää keinotekoisen (esim. resveratrolin avulla aikaan saadun) SIRT1:n aktivoimisen vaikutukset pidemmällä aikavälillä. SIRT1:n liiallisen aktivaation ja anti-apoptoottisten ominaisuuksien seurauksena voisi teoriassa olla joidenkin solujen kasvun villiintyminen ja sitä kautta kasvaimien muodostuminen. SIRT1:a yli-ilmentävien hiirien fenotyyppi muistuttaa monilta osin kalorirajoitusta; niiden veren kolesteroli-, glukoosi- ja insuliinipitoisuudet ovat verrokkeja matalammat. Tästä huolimatta niiden elinaika ei ole pidentynyt, koska lähes kaikki hiiret kuolevat syöpään. (27) Tarvitaankin pitkäaikaistutkimuksia siitä säilyvätkö resveratrolin (ja muiden SIRT1 aktivaattorien) edulliset vaikutukset myös pidemmällä aikavälillä ja mikä niiden vaikutus on eliniän pituuteen. Myös ravinnon eri komponenttien vaikutusta SIRT1:n määrään ja aktivaatioon tulisi selvittää. Länsimaisessa ruokavaliossa omega6 rasvahappojen suhde omega3 rasvahappoihin vaihtelee 1:10 ja 1:30 välillä, kun terveyden kannalta optimaalinen olisi lähempänä 2:1 (jopa 1:1). Omega-3-rasvahapot ehkäisevät metabolian häiriöihin liittyvää pro-inflammatorista aineenvaihduntaa (22). EPA ja DHA laskevat veren triglyseridi- VLDL ja non-HDL-pitoisuuksia sekä vähentävät sydäntapahtumia (23). Olisikin mielenkiintoista selvittää ravinnon omega3-rasvahappojen (EPA ja DHA) sekä omega6/omega3 ?suhteen vaikutusta SIRT1:n aktiivisuuteen ja haitallisten kudosmuutosten kehittymiseen. Ainakin aivoissa omega-3 rasvahapot säätelevät osaltaan Sir2-proteiinien määriä vaurioiden yhteydessä (28). Tässä tutkimuksessa käytettyjen hiirien ravinnon rasva oli peräisin soijapapuöljystä (omega6/omega3 = 7:1) ja laardista. Samoin eri proteiinimäärien ja ?fraktioiden sekä erilaisten bioaktiivisten peptidien vaikutuksia SIRT1:n määrään olisi mielenkiintoista selvittää. On osoitettu että proteiinien kylläisyysvaikutus on suurempi kuin hiilihydraateilla ja rasvoilla. Rasvojen kylläisyysvaikutus puolestaan on suurempi kuin hiilihydraateilla. Siten voitaisiin olettaa että ad libitum dieetti, joka sisältää enemmän proteiinia ja rasvaa suhteessa hiilihydraatteihin, voisi johtaa pienempään kokonaiskalorimäärään. Pienempi kokonaiskalorimäärä puolestaan lisäisi SIRT1- proteiinin määrää mm. sydämessä, lihaksissa ja valkoisessa rasvakudoksessa sekä vähentäisi sen määrää 27 maksassa. Nämä muutokset SIRT1-proteiinin määrissä johtaisivat edullisiin kudosmuutoksiin. Lähteet (1) Rissanen A: Lihavuus Suomessa. Kirjassa: Lihavuus- onegelma ja hoito.Toim.Fogelhol M, Duodecim, Helsinki 1998 (2)Aikuisten lihavuus- Käypä hoitosuositus 2007 (3) Vanhala M: Metabolinen oireyhtymä. Helsinki: Lääkärin käsikirja, 2007 (4)Baur JA, Sinclair DA: Therapeutic potential of resveratrol: the in vivo evidence. Nature 5: 493-506,2006 (5)Sedding D, Haendler J: Do we age on Sirt1 Expression?. Circ. Res. 100:1396- 1398, 2007 (6) Dali-Youcef N, Lagouge M, Froelich S, Koehl C, Schoonjans K, Auwerx J: Sirtuins: The ´magnificent seven`, function, metabolism and longevity. Annals og medicine 39:335-345, 2007 (7)Chen D, Guarente L: SIR2: a potential target for calorie restriction mimetics. Trends Mol Med 13: 64-71, 2007 (8)Alcendor RR, Gao S, Zhai P, Zablocki D, Holle E, Yu X, Tian B, Wagner T, Vatner SF, Sadoshima J: Sirt1 regulates aging and resistance to oxidative stress in the heart. Circ Res. 2007 May 25;100(10):1396-8. (9) Koo S-H, Montminy M: In Vivo Veritas: A Tale of Two Sirt1s?. Cell 127: 1091- 1093, 2006 (10)Lagouge M, Argmann C, Gerhart-Hines Z, Meziane H, Lerin C, Daussin F, Messadeq N, Milne J, Lambert P, Elliot P, Geny B, Laakso M, Puisserver P, Auwerx J: Resveratrol improves mitochondrial function and protects against metabolic disease by activating SIRT1 and PGC-1?. Cell 127: 1-14, 2006 (11)Baur JA, Pearson KJ, Price NL, Jamieson HA, Lerin C, Kalra A, Prabhu VV, Allard JS, Lopez-Lluch G, Lewis K, Pistell PJ, Poosala S, Becker KG, Boss O, Gwinn D, Wang M, Ramaswamy S, Fishbein KW, Spencer RG, Lakatta EG, Le Couteur D, Shaw RJ, Navas P, Puigserver P, Ingram DK, de Cabo R, Sinclair DA. Resveratrol improves health and survival of mice on a high-calorie diet. Nature. 2006 Nov 16;444(7117):337-42. Epub 2006 Nov 1 28 (12) Tuunainen M. Tutkimussuunnitelma: Resveratrolin vaikutus SIRT1-proteiiniin, verenpaineeseen ja rasvakudoksen määrään hiirillä. Kuopion Yliopisto, Farmakologian ja toksikologian laitos 19.9.2007 (13) Koubova and Guarente, Genes Dev 2003;17:313-321 (14) Cohen et al., Science 2004;305:390-392 (15) Haigis and Guarente, Genes Dev 2006;20:2913-2921 (16) Hurst´s The Heart, 11th edition, 2004, Valentin Fuster, R. Wayne Alexander, Robert A. O´Rourke, Robert Roberts, Spencer B. King III, Ira S. Nash, Eric N. Prystowsky (17) Lidia S. Szczepaniak, Ronald G. Victor, Lelio Orci, Roger H. Unger, Forgotten but Not Gone, The Rediscovery of Fatty Heart, the Most Common Unrecognized Disease in America (18) Karin R. Sipido, Stefan P. Janssens, How Old Is Your Heart? From the Department of Cardiovascular Medicine, Divisions of Experimental and Clinical Cardiology, University of Leuven and University Hospital, Leuven, Belgium. Circulation Research 2007;101:323 (19) Gary D. Lopaschuk, Clifford D.L. Folmes and William C. Stanley, Cardiac Energy Metabolism in Obesity Circ. Res. 2007;101;335-347 (20) Kohonnut verenpaine, Käypä hoitosuositus 2005 (21) Aliskiren: new drug. Arterial hypertension: no evidence of clinical efficacy. Prescrire Int. 2008 Apr;17 (94):47-50 (22) Lee S, Gura K, Kim S, Arsenault D, Bistrian B, Puder M. Current clical applications of omega-6 and omega-3 fatty acids. Nutrition in Clinical Practice 2006:21:323?41. (23) Jacobson TA: Role of n-3 fatty acids in the treatment of hypertriglyceridemia and cardiovascular disease. Am J Clin Nutr. 2008 Jun;87(6):1981S-90S. PMID: 18541599 [PubMed - in process] (24) Emily B. Levitan, Nancy R. Cook, Meir J. Stampfer, Paul M. Ridker, Kathryn M. Rexrode, Julie E. Buring, JoAnn E. Manson and Simin Liu: Dietary glycemic index, dietary glycemic load, blood lipids, and C-reactive protein Metabolism. 2008 Mar;57(3):437-43. PMID: 18249220 [PubMed - indexed for MEDLINE] (25) Pharmaca Fennica 29 (26) Leonard Guarente: Sirtuins as potential targets for metabolic syndrome, NATURE|Vol 444|14 December 2006|doi:10.1038/nature05486 (27) Ken Garber: A mid-life crisis for aging theory Nature Biotechnology Volume 26 Number 4 April 2008 (28) Wu A, Ying Z, Gomez-Pinilla F.: Omega-3 fatty acids supplementation restores mechanisms that maintain brain homeostasis in traumatic brain injury. J. Neurotrauma 2007 Oct;24(10):1587-95 (29) Balestrieri ML, Rienzo M, Felice F, Rossiello R, Grimaldi V, Milone L, Casamassimi A, Servillo L, Farzati B, Giovane A, Napoli C: High glucose downregulates endothelial progenitor cell number via SIRT1. Biochimica et Biophysica Acta. 1784(6):936-45, 2008 Jun.