2026-09-22T12:37:02Zhttps://helda.helsinki.fi/server/oai/request

oai:helda.helsinki.fi:10138/333092026-04-16T10:59:24Zcom_10138_18060com_10138_17738col_10138_18068

Katz, Anna University of Helsinki, Faculty of Medicine, Haartman Institute, Virology Helsingin yliopisto, lääketieteellinen tiedekunta, kliinisteoreettinen laitos Helsingfors universitet, medicinska fakulteten, Haartman institutet Hinkkanen, Ari Plyusnin, Alexander Vaheri, Antti 2012-05-14T07:34:18Z 2012-05-22 2012-05-14T07:34:18Z 2012-06-01 http://hdl.handle.net/10138/33309 URN:ISBN:978-952-10-7999-3 The Uukuniemi virus (UUKV) is a member of the Bunyaviridae family (genus Phlebovirus). The virus was isolated from Ixodes ricinus ticks from Uukuniemi, Finland in 1959 and was found to be non-pathogenic for humans. UUKV has served for more than four decades as an excellent model to study the molecular and cellular biology of the serious human pathogens that reside within this group. UUKV has a segmented, single-stranded RNA genome of negative polarity. The three RNA segments (S, M, and L) encode four structural proteins: a nucleocapsid (N) protein, two glycoproteins (Gn and Gc), and an RNA-dependent RNA polymerase (L protein). In addition, a non-structural protein (NSs) is encoded from the S segment using an ambisense coding strategy. At the termini of the RNA segments, there are non-coding regions, which contain regulatory elements for viral transcription and replication. The very terminal 5' and 3' ends within all non-coding regions are complementary to each other, and highly conserved within the genus. In order to function as templates for transcription and replication, all three RNA segments must be encapsidated by the N protein. The N protein forms oligomers, in which N protein molecules are bound to each other; this oligomer associates with RNA. This study focused on analyzing the function of the non-coding regions in the termini of the RNA segments, and on locating amino acid residues or domains of the UUKV N protein, which could potentially be involved in the oligomerization or RNA-binding. The function of the non-coding regions was studied using a minigenome system developed for UUKV, where the viral protein coding sequence is replaced by sequences encoding a reporter protein. The cells are transfected with the minigenomes and helper plasmids, and after replication and transcription of the minigenomes, the reporter protein expression can be measured. The non-coding regions of all three RNA segments were analyzed and promoter strengths and packaging efficiencies were compared. The results showed that the non-coding regions in all three RNA segments contain all the necessary signals for initiation of transcription and replication and encapsidation and packaging of the RNA segments. The strongest promoter strength was observed in M segment, followed by L and S segments. The role of the intergenic region, which is located between the N and NSs genes in the UUKV S segment was also analyzed and was found to regulate termination of transcription. To study the oligomerization and RNA-binding of UUKV N protein, a set of N protein mutants were generated based on 2D and 3D predictions of the N protein. The functionality of these mutants was analyzed using mammalian two-hybrid-, minigenome-, and virus-like particle-assays, which showed that both the N- and C-termini of the N protein are needed for the oligomerization. A specific structure in the N-terminal region plays an important role in the N-N interactions. Some putative RNA-binding residues were found, which severely affected the N protein functionality in all three assays. These residues were located within the proposed RNA-binding cavity in the predicted UUKV N protein models. These results are in agreement with observations with other bunyaviruses, and could help to better understand the molecular biology of bunyaviruses. Moreover, understanding the details of the oligomerization and RNA-binding of the N protein could help in design of potential antivirals for the pathogenic phleboviruses. Uukuniemi-virus (UUKV) kuuluu suureen, maailmanlaajuiseen Bunyaviridae -virusheimoon, sukuun Phlebovirus. Monet bunyavirukset voivat aiheuttaa vakavia tauteja sekä ihmisille että eläimille, esimerkiksi verenvuotokuumetta ja aivotulehduksia. Suurin osa viruksista leviää hyttysten ja punkkien välityksellä, eikä tauteja vastaan vielä ole olemassa tehokkaita rokotteita. UUKV löydettiin Ixodes ricinus -puutiaisesta Itä-Suomessa v. 1959. Viruksen ei ole todettu aiheuttavan ihmiselle vaaraa, ja sitä onkin pitkään käytetty malliviruksena tutkittaessa vaarallisempien bunyavirusten rakennetta ja toimintaa. Viruksen perimä koostuu kolmesta yksijuosteisesta, negatiivisesti koodatusta RNA-juosteesta. Nämä kolme juostetta S, M, ja L koodaavat neljää rakenneproteiinia: nukleokapsidiproteiinia (N-proteiini), kahta viruksen pinnalla olevaa glykoproteiinia, sekä viruksen RNA-juosteiden monistamiseen tarvittavaa polymeraasia. Kaikilla bunyaviruksilla on RNA-juosteiden päissä säätelyalueet, jotka ohjaavat RNA-juosteiden replikaatiota ja transkriptiota, ja sitä miten eri RNA-juosteet pakataan muodostuviin viruspartikkeleihin. RNA-juosteista S (small) koodaa N-proteiinia: useista N-proteiineista muodostuu N-proteiinioligomeeri, joka puolestaan sitoutuu viruksen RNA:han suojaten sitä. Tämä ribonukleiinikompleksi toimii alukkeena viruksen replikaatiossa, ilman RNA:han sitoutunutta N-proteiinia virus ei pysty lisääntymään. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin, miten viruksen RNA-juosteiden päissä olevat säätelyalueet vaikuttavat RNA-juosteiden replikaatioon ja siiihen, miten RNA-juosteet pakataan muodostuvien viruspartikkelien sisään. Lisäksi tutkittiin N-proteiinin rakennetta, kuinka N-proteiini muodostaa RNA:ta suojaavan, useista N-proteiineista koostuvan oligomeerin, ja sitä, mitkä alueet N-proteiinista sitoutuvat RNA:han. Tutkimuksen kolme keskeisintä tulosta ovat: 1) viruksen RNA-juosteiden alussa ja lopussa olevat alueet sisältävät kaiken viruksen tarvitseman tiedon viruksen RNA-juosteiden monistamista ja säätelyä varten, sekä signaalit joiden avulla virus pakkaa RNA-juosteet muodostuvien viruspartikkelien sisälle. 2) Sekä N-proteiinin alku- että loppupää osallistuvat N-proteiineista koostuvan oligomeerin muodostamiseen, tässä prosessissa erityisesti N-proteiinin alkupään muodostama rakenne on tärkeä. 3) N-proteiinista kartoitettiin alueita ja yksittäisiä aminohappoja, jotka todennäköisesti osallistuvat ribonukleiinikompleksin muodostumiseen. Väitöskirjatyössä saavutettujen tutkimustulosten avulla voidaan ymmärtää paremmin myös muiden, vaarallisten bunyavirusten rakennetta ja toimintaa. N-proteiinin ja RNA:n välisen vuorovaikutuksen tunteminen voi esimerkiksi auttaa kehittämään lääkkeitä tai rokotteita vaarallisia bunyaviruksia vastaan. unknown accessibility ei tietoa saavutettavuudesta okänd tillgänglighet application/pdf eng Helsingin yliopisto Helsingfors universitet University of Helsinki Helsinki University Biomedical Dissertations 978-952-10-7998-6 1457-8433 Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited. Publikationen är skyddad av upphovsrätten. Den får läsas och skrivas ut för personligt bruk. Användning i kommersiellt syfte är förbjuden. virologia Functional analysis of the non-coding regions of RNA segments and the nucleocapsid protein of the Uukuniemi virus Doctoral dissertation (article-based) Artikkeliväitöskirja Artikelavhandling Text doctoralThesis open.access