2026-09-22T16:17:10Zhttps://helda.helsinki.fi/server/oai/request

oai:helda.helsinki.fi:10138/415682026-04-16T10:14:29Zcom_10138_18060com_10138_17738col_10138_18063

Koskinen, Kaisa University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Department of Environmental Sciences Helsingin yliopisto, bio- ja ympäristötieteellinen tiedekunta, ympäristötieteiden laitos Helsingfors universitet, bio- och miljövetenskapliga fakulteten, miljövetenskapliga institutionen Bertilsson, Stefan 2013-10-17T11:01:18Z 2013-11-19 2013-10-17T11:01:18Z 2013-11-29 http://hdl.handle.net/10138/41568 URN:ISBN:978-952-10-9323-4 Microbes are essential for all life on Earth. They are found in all viable habitats from deep sea sediments and bedrock to high up in the atmosphere with a variety that exceeds by far the eukaryotic diversity. Ecosystem services provided by microorganisms, such as degradation of organic material and mediation of biogeochemical cycles are fundamentally important for the whole biosphere and its inhabitants. Microbes also form symbiotic relationships with multicellular organisms, and play important roles in nutrition and disease. Recent developments in molecular techniques, especially the next generation sequencing technologies and microarray applications, have opened new possibilities in studying diverse microbial communities. In this thesis, the aim was to determine the diversity and community structure of environmental samples collected from the northern Baltic Sea water column and anaerobic digestion reactor, and to assess how the prevailing abiotic factors affect the microbial community structure. We applied 16S rRNA and ITS gene amplicon sequencing method with 454 sequencing technology to form a detailed taxonomic description of studied communities. The produced sequence data was further utilised in designing probes for a new padlock probe based ligation detection reaction (LDR) microarray that could be employed for specific and sensitive taxonomic identification of microbial groups in diverse communities. The functionality, specificity and sensitivity of the microarray were assessed using artificial and real environmental samples. Additionally, selected amplicon sequencing data analysis methods were compared in order to discover which algorithms work most reliably. In this subproject, we aimed to clarify how significantly the selected analysis methods, specifically denoising and clustering algorithms, affect the results and how comparable the results derived from different analysis pipelines are. Amplicon sequencing revealed diverse microbial communities in the northern Baltic Sea water column and anaerobic digestion reactor. The pelagic bacterial communities in the northern Baltic Sea were strongly stratified, with aerobic Bacteria such as Pseudomonas and Flavobacterium dominating in the surface layer and Oleispira and sulfate-reducing bacteria in the anoxic deep waters. Based on the sequence data the diversity was assessed one order of magnitude less diverse compared to Atlantic and Pacific ocean bacterial communities. The anaerobic digestion reactor communities were dominated by Bacteria belonging to phyla Bacteroidetes, Firmicutes and Thermotogae and methanogenic Archaea, all essential and typical degraders in anaerobic digestion. The process also supported a diverse fungal community of phyla Ascomycota and Basidiomycota, including several taxa capable of degrading organic material in anaerobic conditions. The LDR microarray technology proved sensitive, specific and semiquantitative method for identifying microbes in diverse communities. The proof of principle tests and experiments with real environmental samples showed that if the probes are designed carefully, the detection is comparable to qPCR and amplicon sequencing. The detection limit was 0.01 fmol/µl/template. Data analysis method comparisons revealed prominent differences in observed operational taxonomic units and relative abundance of identified taxa. The majority of tested methods assessed the species richness too high. Using a functioning denoising method evened out the differences in the number of observed OTUs caused by various clustering algorithms. The ability to filter out the spurious taxa produced by amplification and sequencing, but still retain all the real diversity varied between methods. This study shows both the potential and the challenges in the use of amplicon sequencing and microarray technologies in studying diverse microbial communities. The results indicate that the padlock based LDR microarray can be designed for very accurate and sensitive identification of microbial groups of interest. The data suggest that amplicon sequencing is a powerful tool in identifying microbes and assessing the diversity but distinguishing between spurious and true community members remain a challenge. There is still work to be done in the development and application of data analysis tools. Mikrobit ovat mikroskooppisen pieniä eliöitä, jotka elävät lähes kaikenlaisissa ympäristöissä ja olosuhteissa aina merien syvänteiden sedimenteistä ylempiin ilmakehän kerroksiin asti. Ne ovat täysin välttämättömiä elämälle maapallolla: mikrobeilla on keskeinen rooli aineiden kierrossa, ne muodostavat symbioottisia suhteita monisoluisten eliöiden kanssa, ja vaikuttavat merkittävästi ravitsemukseen sekä sairauksiin. Uuden sukupolven sekvensointitekniikoiden sekä mikrosirusovellusten nopea kehitys on luonut uusia mahdollisuuksia mikrobien ja monimuotoisten mikrobiyhteisöjen tutkimiseen. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin pohjoisen Itämeren sekä mädättämöprosessin mikrobiyhteisöjen rakennetta ja monimuotoisuutta 454-sekvensointimenetelmällä ja kehitettiin uusi ligaatioreaktioon perustuva DNA-mikrosiru kohdesekvenssien tarkkaan tunnistamiseen monimuotoisissa mikrobiyhteisöissä. Mikrosirun herkkyyttä ja tarkkuutta arvioitiin sekä keinotekoisten että oikeiden ympäristönäytteiden avulla. Sekvenssianalyysityökalujen luotettavuutta tutkittiin vertailemalla yleisesti käytettyjä algoritmeja. Pyrimme selvittämään, kuinka merkittävästi eri analyysityökalut vääristävät tuloksia ja voidaanko eri menetelmiä käyttäen saatuja tuloksia vertailla keskenään. Tutkitut ympäristönäytteet osoittautuivat mikrobiyhteisöiltään monimuotoisiksi. Pohjoisen Itämeren bakteeriyhteisöt olivat voimakkaasti kerrostuneita: pintavedessä viihtyivät aerobiset bakteerit kuten Pseudomonas ja Flavobacterium, kun taas läheltä pohjaa hapettomista oloista tunnistimme mm. öljyä hajottavia Oleispira-bakteereja sekä sulfaattia pelkistäviä bakteerisukuja. Aineistomme perusteella Itämeren bakteerien monimuotoisuus vaikuttaa kuitenkin valtameriä vaatimattomammalta. Mädättämöjen yleisimpiin mikrobeihin lukeutuivat mm. Bacteroidetes-, Firmicutes- ja Thermotogae-pääjaksojen bakteerit sekä metaania tuottavat arkit, joiden tiedetään olevan tyypillisiä mädättämöjen asukkeja. Prosessissa oli läsnä myös hyvin monimuotoinen sieniyhteisö, jonka jäsenien tiedetään kykenevän orgaanisen aineksen hajotukseen hapettomissa olosuhteissa. Kokeidemme perustella uusi mikrosirumenetelmä toimi herkästi ja tarkasti. Mikrosirun avulla kyettiin havaitsemaan mitkä mikrobiryhmät ovat läsnä näytteissä ja signaalin voimakkuuden perusteella voitiin päätellä oliko kyseessä yleinen vai vähän harvinaisempi mikrobi. Menetelmän tunnistusrajaksi määrittyi 0.01 fmol/µl/näytettä ja hyvin suunnitelluilla koettimilla mikrobien tunnistuksessa voidaan päästä kvantitatiivisen PCR-menetelmän ja amplikonisekvensoinnin tasolle. Eri sekvenssianalyysityökaluilla saadut tulokset poikkesivat merkittävästi toisistaan. Erityisesti erilaisten mikrobityyppien määrää arvioitaessa on oltava varovainen, sillä osa menetelmistä arvioi monimuotoisuuden jopa kertaluokan todellisuutta suuremmaksi ja erot menetelmien välillä olivat huomattavat. Myös mikrobiryhmien taksonomisesta luokittelusta löytyi tilastollisesti merkitseviä eroja menetelmien välillä. Tämä väitöskirjatyö tuo esille amplikonisekvensoinnin ja mikrosiruteknologian mahdollisuudet sekä haasteet monimuotoisten mikrobiyhteisöjen tutkimisessa. Menetelmät sopivat hyvin mikrobien tunnistamiseen monimuotoisista ympäristönäytteistä, mutta analyysityökalujen kehittämisessä riittää vielä työtä. unknown accessibility ei tietoa saavutettavuudesta okänd tillgänglighet application/pdf eng Helsingin yliopisto Helsingfors universitet University of Helsinki 978-952-10-9322-7 Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited. Publikationen är skyddad av upphovsrätten. Den får läsas och skrivas ut för personligt bruk. Användning i kommersiellt syfte är förbjuden. ympäristöekologia Characterisation of diverse microbial communities and application of novel detection techniques Doctoral dissertation (article-based) Artikkeliväitöskirja Artikelavhandling Text doctoralThesis open.access