Lintala, Annika2025-10-102025-10-102025-11-21978-952-84-1585-5http://hdl.handle.net/10138/602532Boid inclusion body disease (BIBD) affects constrictor snakes and is diagnosed by the presence of inclusion bodies in the snake’s tissues. BIBD causes varying signs such as weight loss, severe central nervous system disturbance, and reduced immune efficiency. BIBD was described in the 1970s and has since been reported to affect multiple constrictor snake species in private collections around the globe. Arenaviruses were identified as the causative agent of BIBD in 2012, which led to the establishment of two novel genera, Reptarenavirus and Mammarenavirus in the Arenaviridae family. Reptarenaviruses and BIBD are most often detected in boas and pythons, but whether snakes are the natural hosts for reptarenaviruses is still not known. BIBD spreads efficiently to other snakes, spreading easily through the entire population. BIBD has been mostly described from captive snake collections, and the disease and the viruses were found in the wild for the first time in 2022 from a Costa Rican snake. While the evidence indicates reptarenaviruses to cause BIBD, the pathogenesis mechanisms remain unknown. Reptarenaviruses are enveloped, bisegmented, RNA viruses, i.e., their small (S) and large (L) RNA genome segments are packaged inside a lipid envelope. Snakes with BIBD often carry a variety of genetically diverse reptarenavirus S and L segments, in most cases L segment variety outnumbering the S segment variety. Curiously, the evidence suggests that the variety of reptarenavirus S and L segments can vary between the tissues of a BIBD-positive snake. Coincidentally to reptarenavirus infection, BIBD-positive snakes often carry hartmaniviruses, another arenavirus genus, the role of which in BIBD pathogenesis remains undefined. Experimentally reptarenavirus infected snake studies have indicated the viruses to establish persistent infection in the snakes. The goal of this thesis was to understand the dynamics and limitations of persistent reptarenavirus infections, co- and superinfection competition dynamics, segment accumulation, and tissue/species tropism of the segments, as well as generally define the similarities and differences between rept- and mammarenaviruses. In the first study our aim was to generate and characterize persistently reptarenavirus infected (pi) cell cultures. In addition to establishing several pi cell lines, we developed cross-reactive antibodies and segment-specific qRT-PCR, research tools applicable in the following studies. While monitoring the first 10 passages, we found the replication rate or genome copy numbers to fluctuate between passages. Furthermore, we found the expression level of viral glycoproteins (GP) to drastically decline over the passages, while nucleoprotein production appeared to remain steady. We did not observe marked changes in cell morphology as a result of viral infection or persistence. Our goal in the second study was to understand co- and superinfection dynamics. We hypothesized that co- and superinfection with genetically similar reptarenaviruses would lead to virus exclusion. Coinfection did not appear to impact replication, however, in superinfection setting genetically similar reptarenaviruses appeared to hinder each other’s replication. Coculturing of genetically similar reptarenaviruses for a longer period led to restrictive infection and exclusion of the other. We further studied whether the expression of viral Z protein, known to impact mammarenavirus replication, would mediate superinfection exclusion, but found this not to be the case. In the third study, we studied whether reptarenavirus S and L segment combinations affect the species or tissue tropism. The results suggested that tissue origin played a greater role than the snake species from which the culture originated from. The results further led us to suspect preferred pairing between reptarenavirus S and L segments, which would support the hypothesis that each L segment has a designated S segment that it coevolved with, and that there are ~20 S segments yet to be found. In conclusion, this thesis broadens the understanding of reptarenavirus biology by providing new insights into the dynamics of persistent infections and the factors influencing co- and superinfection. It highlights the wide tissue tropism of reptarenaviruses and suggests a restrictive infection model for genetically similar viruses.Boakäärmeiden inkluusiokappale-tauti (boid inclusion body disease, BIBD) vaikuttaa kuristajakäärmeisiin ja se diagnosoidaan kudoksista inkluusiokappaleiden läsnäolon myötä. BIBD:n oireita ovat mm. painonlasku, keskushermosto-oireet ja heikentynyt immuunipuolustus. BIBD tunnistettiin 1970-luvulla, jonka jälkeen BIBD:iä on havaittu useissa kuristajakäärmelajeissa yksityisissä käärmekokoelmissa ympäri maailmaa. Arenavirusten todettiin olevan BIBD-taudin aiheuttaja vuonna 2012, mikä johti Arenaviridae-virusheimon uudelleenluokitteluun reptarena- ja mammarenaviruksiksi. Todisteet tukevat vahvasti reptarenavirusten roolia BIBD:n aiheuttajina, taudin syntymekanismeja ei edelleenkään tunneta tarkkaan. Reptarenaviruksia ja BIBD:tä on havaittu useimmiten boakäärmeissä ja pytoneissa, mutta reptarenavirusten luonnollista isäntää ei kuitenkaan vielä tunneta. BIBD leviää tehokkaasti tartuttaen helposti koko käärmepopulaation. Tauti todettiin ensimmäistä kertaa luonnonvaraisissa käärmeissä vuonna 2022 Costa Rican käärmenäytteistä. Reptarenavirukset ovat vaipallisia, jaokkeellisia RNA-viruksia. Niiden perimä muodostuu kahdesta segmentistä, pienestä (small, S) ja suuresta (large, L), jotka on pakattu viruksen lipidivaipan sisään. BIBD:tä sairastavilla käärmeillä on usein monenlaisia geneettisesti erilaisia reptarenavirus S ja L segmenttejä, ja usein L segmenttejä on enemmän kuin S segmenttejä. Reptarenavirusten S ja L segmenttien yhdistelmät on huomattu vaihtelevan kudoskohtaisesti BIBD-positiivisissa käärmeissä. BIBD-positiivisilta käärmeiltä löytyy usein reptarenavirusten lisäksi myös arenaviruksiin kuuluvia hartmaniviruksia. Hartmanivirusten roolia BIBD:n kehittymisessä ei ole vielä todettu. Kokeellisissa infektiotutkimuksissa on näytetty, että reptarenavirukset voivat aiheuttaa pysyvän infektion käärmeissä. Tämän väitöskirjan tavoitteena oli ymmärtää pysyvien reptarenavirusinfektioiden dynamiikkaa ja rajoituksia, yhteis- ja superinfektion kilpailudynamiikkaa, geneettisesti erilaisten segmenttien kertymistä ja niiden kudos-/lajitropismia sekä yleisesti tarkentaa rept- ja mammarenavirusten välisiä yhtäläisyyksiä ja eroja. Ensimmäisessä tutkimuksessa tavoitteenamme oli tuottaa ja kuvailla pysyvästi reptarenaviruksilla infektoituja (persistently infected, pi) soluviljelmiä. Usean pi-solulinjan perustamisen lisäksi tuotimme yleisesti reptarenaviruksiin reagoivia vasta-aineita sekä segmenttispesifisiä qRT-PCR-menetelmiä tutkimuksia varten. Seuratessamme 10 ensimmäistä pasaasia havaitsimme replikaatiotehokkuuden vaihtelevan pasaasien välillä. Lisäksi havaitsimme, että viruksen glykoproteiinien tasot laskivat huomattavasti samalla kun nukleoproteiinia tuotettiin soluissa tasaisesti. Emme havainneet merkittäviä muutoksia solujen morfologiassa virusinfektioiden seurauksena. Toisessa tutkimuksessa tavoitteemme oli ymmärtää yhteis- ja superinfektioiden dynamiikkaa. Hypoteesina oli, että geneettisesti samankaltaisten reptarenavirusten yhteis- ja superinfektio johtaisi toisen viruksen häviämiseen. Yhteisinfektio ei näyttänyt vaikuttavan virusten replikaatioon, mutta superinfektiotilanteessa geneettisesti samankaltaiset reptarenavirukset näyttivät vaikuttavan toistensa replikaatioon. Geneettisesti samankaltaisten reptarenavirusten pitkäaikainen yhteisviljely osoitti kilpailua, joka johti toisen viruksen häviämiseen soluviljelmästä. Tutkimme lisäksi viruksen Z-proteiinin vaikutusta superinfektion estymiseen, kuten sen tiedetään vaikuttavan mammarenaviruksen replikaatioon. Tuloksemme eivät kuitenkaan tukeneet tätä hypoteesia. Kolmannessa tutkimuksessa tarkastelimme, miten reptarenavirusten S- ja L-segmenttien yhdistelmät vaikuttavat laji- ja kudostropismiin. Tuloksemme osoittivat, että kudoksen alkuperä vaikutti virusten replikaatioon soluissa enemmän kuin käärmelaji. Lisäksi havainnot viittasivat siihen, että tietyt S- ja L-segmentit replikoituivat vain tiettyinä pareina. Tämä tukee hypoteesia, jonka mukaan jokainen L-segmentti on kehittynyt yhdessä tietyn S-segmentin kanssa, ja viittaa vielä noin 20:een tunnistamattomaan S-segmenttiin. Tämä väitöskirja laajentaa ymmärrystä reptarenavirusten biologiasta tarjoamalla uusia näkemyksiä pysyvien infektioiden dynamiikasta ja yhteis- ja superinfektioon vaikuttavista tekijöistä. Se korostaa reptarenavirusten laajaa kudostropismia ja esittää geneettisesti samankaltaisten virusten rajoittavaa infektiomallia.application/pdfengJulkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.Publikationen är skyddad av upphovsrätten. Den får läsas och skrivas ut för personligt bruk. Användning i kommersiellt syfte är förbjuden.virologiaURN:ISBN:978-952-84-1585-5ArtikkeliväitöskirjafulltextDoctoral Programme in Microbiology and BiotechnologyMikrobiologian ja biotekniikan tohtoriohjelmaDoktorandprogrammet i mikrobiologi och bioteknik11832 Mikrobiologia ja virologia11832 Mikrobiologi och virologi11832 Microbiology and virology