Helsingin yliopisto, Farmasian tiedekuntaUniversity of Helsinki, Faculty of PharmacyHelsingfors universitet, Farmaceutiska fakultetenHyttinen, Nea2023-11-232023-11-232023URN:NBN:fi:hulib-202311154063http://hdl.handle.net/10138/567492Krooniset haavat ovat maailmanlaajuinen ongelma. Ne aiheuttavat paljon kustannuksia yhteiskunnalle ja voivat vaikuttaa merkittävästi potilaan elämänlaatuun. Ihmisen rasvan kantasoluja (hASC) on tutkittu yhtenä hoitomuotona kroonisten haavojen hoitoon, koska ne kykenevät edistämään haavojen paranemista monin eri tavoin. HASC:ien erittämät solunulkoiset vesikkelit (EV:t) ovat otollinen vaihtoehto, sillä niiden avulla välittyvät hASC:ien hyödyt, mutta näiden mahdollisia ongelmia, kuten mutageenisyyttä, pystytään välttämään. HASC-EV:den on huomattu edistävän haavan paranemista esimerkiksi lisäämällä verisuonten uudismuodostusta ja fibroblastien jakautumista. HASC:eja voidaan kasvattaa 2D soluviljelynä, jossa solut kiinnittyvät kasvatusalustan pohjaan tai 3D soluviljelynä, jossa solut kiinnittyvät toisiinsa ja muodostavat sferoideja. 2D solukasvatus on helppoa ja edullista, mutta 3D kasvatetut solut mallintavat enemmän in vivo -ympäristöä. Näiden in vivo -tyyppisten piirteiden takia, 3D kasvatetut hASC:it saattavat tuottaa EV:tä, jotka muistuttavat enemmän isäntäsolujaan kuin 2D kasvatetut. Tämän tutkielman tavoitteena oli vertailla 2D-kasvatusta, matriisipohjaista nanoselluloosa-hydrogeelikasvatusta (NFC) ja matriisivapaata suspensiokasvatusta kasvualustoina hASC:lle ja EV:den jatkuvaan tuotantoon. Kasvatuksen aikana solujen kasvumedia kerättiin, jonka jälkeen EV:t eristettiin ja EV:den konsentraatio ja kokojakauma määritettiin nanopartikkelien seuranta-analyysillä (NTA). Kasvatuksen jälkeen solujen metabolinen aktiivisuus mitattiin ja loput soluista kerättiin immunosytokemialliseen kokeeseen (ICC), western blot -kokeeseen ja kvantitatiiviseen polymeraasiketjureaktioon (qPCR) solujen erilaistumisen ja kantasolumaisuuden säilyttämisen tutkimiseksi. Tämän tutkielman hypoteesi oli, että NFC-hydrogeeli tuottaa eniten EV:itä, jotka ovat omaisuuksiltaan parhaimpia terapeuttiseen käyttöön. Näiden tulosten perusteella tätä hypoteesia ei voida tukea. Kun solukasvatuksia tutkittiin visuaalisesti, kaikkien kolmen kasvatusmenetelmän solut olivat elinvoimaisia, mutta NFC:ssä hASC:ien metabolinen aktiivisuus oli alhainen verrattuna 2D- ja suspensiokasvatukseen. Myös saatu EV-, proteiini- ja RNA-määrä oli alhaisempi NFC:ssä. ICC, western blot ja qPCR -tulokset olivat riittämättömiä suoraan yhteenvetoon siitä, mikä kasvatusmenetelmä on parhain EV:den tuotantoon. Tutkittaessa tuloksia kokonaisuudessaan, 2D kasvatus tuotti eniten EV:itä ja RNA:ta, sillä oli paras metabolinen aktiivisuus ja 2D-kasvatus oli kaikista helpoin kasvatusmenetelmä, jonka takia 2D-solukasvatus sopii hyvin jatkuvaan EV-tuotantoon. Suspensiokasvatus muistuttaa enemmän in vivo -olosuhteita, minkä takia se voisi mahdollisesti tuottaa parempia EV:itä terapeuttiseen käyttöön. EV-metabolomiikka olisi mielenkiintoinen tulevaisuuden tutkimuskohde, jotta voitaisiin tutkia näiden in vivo -ominaisuuksien vaikutuksia EV:siin.Chronic wounds are a worldwide health problem that produce a lot of costs for society and can have a substantial impact on patients’ quality of life. Human adipose stem cells (hASCs) have been studied as a treatment option for chronic wounds as they can induce wound healing in many ways. Extracellular vesicles (EVs) produced by hASCs are a great solution to acquire the benefits of hASCs while avoiding their problems such as possible mutagenicity. HASC-EVs have been found to induce wound healing by for example enhancing angiogenesis and fibroblast proliferation. HASCs can be grown in 2D where the cells attach to the bottom of the cell culture vessel or in 3D where the cells attach to each other and create a spheroid. 2D cell culturing is easy and inexpensive but 3D cultured cells resemble in vivo –like conditions more. Because of these in vivo -like features, hASCs grown in 3D might produce EVs that resemble the properties of host cells in natural environment more than 2D. The aim of this thesis was to compare 2D culture, matrix-based nanofibrillar cellulose (NFC) hydrogel culture, and matrix-free suspension culture in ultra-low attachment (ULA) wells as growing platforms for hASCs and as continuous EV production methods. During culturing, the conditioned media was collected after which, the EVs were isolated, and the EV concentration and size range was measured with nanoparticle tracking analysis (NTA). After culturing, the metabolic activity of hASCs was measured and the cells were collected for immunocytochemistry (ICC) assay, western blot (WB) assay, and for quantitative PCR (qPCR) to examine the stemness and differentiation of hASCs grown in different cell cultures. The hypothesis of this thesis was that the NFC cell culture would produce the best EV yield and the best EVs for therapeutic use. Based on the acquired results, this hypothesis could not be supported. When visually inspecting the cells, all three cell cultures were viable but the metabolic activity of hASCs in NFC hydrogel was low compared to 2D and suspension cultures. Also, the EV, protein and RNA yield were lower in NFC. ICC, western blotting, and qPCR results were inadequate to make a straightforward implication of what cell culturing condition is the best for EV production and they would need repetition and optimization. Looking at the overall results, 2D cell culturing produced the best EV and RNA yield, had the highest metabolic activity and was least laborious cell culturing method which makes it a good option for continuous EV production. Suspension culture on the other hand resembles in vivo -like environment which could possibly produce better EVs for therapeutic use. The metabolomic assays on the EVs would be interesting to perform in the future to examine if the in vivo –like features affect the quality of EVs.engHuman adipose stem cellsextracellular vesicles2D cell culture3D cell cultureNFC hydrogelpro gradu -tutkielmatBiofarmasiaBiopharmaceuticsBiofarmaciProviisorin koulutusohjelmaMaster's Programme in PharmacyUtbildningsprogrammet för provisorsexamen