Kahma, Helinä2025-10-062025-10-062025-10-31978-952-84-1543-5http://hdl.handle.net/10138/602021Cytochrome P450 (CYP) enzymes play a central role in drug metabolism, and their inhibition can lead to altered drug exposure, toxicity or therapeutic failure. Mechanism-based inhibition (MBI), irreversible enzyme inactivation caused by a reactive metabolic intermediate inside the active site of the enzyme, is particularly concerning due to its long-lasting effect and potential to cause clinically significant drug-drug interactions (DDIs). While parent drugs have traditionally been the focus of DDI studies, there is increasing evidence that drug metabolites, including glucuronides, can also contribute to CYP inhibition and DDIs. This doctoral thesis investigated the role of glucuronide metabolites in MBI of CYP enzymes using in vitro, in silico and in vivo approaches. Moreover, the methodological challenges in detecting mechanism-based CYP inhibition in vitro were explored and a novel screening method was developed for efficient detection of MBI of major drug-metabolizing CYP enzymes. Clopidogrel acyl-β-D-glucuronide, a potent mechanism-based CYP2C8 inhibitor that causes significant increases in the plasma concentrations of CYP2C8 substrate drugs, was shown to be formed primarily by hepatic uridine-5’-diphosphate glucuronosyltransferase (UGT) 2B7 and intestinal UGT2B17 in vitro. Pharmacogenetic analysis indicated that individuals with the UGT2B17 deletion exhibited lower systemic exposure to clopidogrel acyl-β-D-glucuronide. This variability may be reflected in the extent of CYP2C8 inactivation caused by clopidogrel. Significant discrepancies in CYP2C8 inactivation by known mechanism-based inhibitors were observed between human recombinant CYP2C8 preparations and human liver microsomes (HLMs) in vitro. Contrary to HLMs, CYP2C8 inactivation by clopidogrel acyl-β-D-glucuronide and gemfibrozil 1-O-β-glucuronide could not be detected in some recombinant enzyme preparations. The findings highlight the potential for false-negative results when using recombinant CYP2C8 preparations, and reinforce the role of HLMs as the gold standard in CYP inhibition screening. To address the need for a reliable and efficient screening method for MBI, a novel automated in vitro substrate cocktail method was developed and validated for simultaneous assessment of direct and time-dependent inhibition of CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2J2, and CYP3A. Probe substrates were carefully chosen to ensure selectivity. Substrate-substrate interactions were minimized with a two-cocktail approach. Using known CYP inhibitors, the method demonstrated its ability to detect both direct and time-dependent CYP inhibition. In selectivity screening with the validated method, gemfibrozil 1-O-β-glucuronide and clopidogrel acyl-β-D-glucuronide were shown to be highly selective CYP2C8 inactivators. In a systematic evaluation of glucuronide metabolites as potential CYP inactivators, 16 glucuronide metabolites, selected based on structural alerts, known MBI potential of the parent drug and/or plasma exposure of the glucuronide, were screened using the validated substrate cocktail method. Seven glucuronides exhibited time-dependent CYP inhibition, with carvedilol β-D-glucuronide showing the strongest inhibitory effect. Further investigations revealed that the parent drug carvedilol is a more potent CYP3A inactivator than its glucuronide. Carvedilol and diclofenac acyl-β-D-glucuronide were shown to cause irreversible CYP3A inactivation, suggesting a potential clinical risk for DDIs involving CYP3A substrates. In static in silico models, carvedilol was predicted to result in clinically relevant DDIs with CYP3A substrates midazolam and simvastatin, aligning with clinical data on carvedilol’s interaction with cyclosporine. Overall, this work advances the understanding of glucuronide-mediated CYP inactivation and provides methodological improvements for screening of mechanism-based CYP inhibitors. The identification of new glucuronide metabolites with MBI effects highlights the need to acknowledge the CYP inhibitory potential of metabolites in DDI risk assessment. The automated substrate cocktail method developed in this study represents a valuable tool for early-stage screening of CYP inhibition, ensuring more accurate predictions of in vivo drug interactions.Suurin osa kliinisesti käytetyistä lääkkeistä metaboloituu sytokromi P450 (CYP) -entsyymien välityksellä, ja niiden toiminnan esto voi johtaa lääkeainepitoisuuksien nousun tai laskun aiheuttamiin haittavaikutuksiin tai terapeuttisen tehon puutteeseen. Osa lääkeaineista estää CYP-entsyymejä palautumattomasti reaktiivisen välituotteen välityksellä. Tämä niin sanottu mekanismiin perustuva estovaikutus (MBI) on pitkäkestoinen ja altistaa kliinisesti merkittäville lääkeyhteisvaikutuksille. Lääkeyhteisvaikutustutkimuksissa ei ole perinteisesti keskitytty lääkkeiden aineenvaihduntatuotteisiin (metaboliitteihin). On kuitenkin lisääntyvää näyttöä siitä, että myös lääkkeiden metaboliitit voivat estää CYP-entsyymejä ja aiheuttaa siten haitallisia lääkeyhteisvaikutuksia. Tämän väitöskirjan tavoitteena oli tutkia lääkeaineiden glukuronidirakenteisten metaboliittien roolia CYP-entsyymien MBI-estäjinä in vitro-, in silico- ja in vivo -menetelmiä hyödyntäen. Lisäksi työssä paneuduttiin MBI:n havaitsemisen haasteisiin in vitro -menetelmissä ja kehitettiin uusi seulontamenetelmä, joka mahdollistaa tärkeimpien CYP-entsyymien MBI:n tehokkaan ja luotettavan seulonnan. Klopidogreelin glukuronidimetaboliitti on voimakas mekanismiin perustuva CYP2C8-estäjä, joka nostaa merkittävästi CYP2C8:n välityksellä metaboloituvien lääkkeiden plasmapitoisuuksia. In vitro -tutkimuksessa havaittiin, että klopidogreeliasyyli-β-D-glukuronidi muodostuu pääasiassa uridiini-5'-difosfaattiglukuronosyylitransferaasi (UGT) 2B7:n välityksellä maksassa ja UGT2B17:n välityksellä suolistossa. In vivo -aineiston farmakogeneettinen analyysi osoitti, että UGT2B17-deleetiota kantavilla yksilöillä oli pienempi systeeminen altistus klopidogreeliglukuronidille. Tämä vaihtelu voi mahdollisesti heijastua klopidogreeliglukuronidin aiheuttaman CYP2C8:n inaktivaation kliiniseen ilmentymiseen. In vitro -tutkimuksessa havaittiin, että ihmisen rekombinantti-CYP2C8-valmisteissa ei aina pystytty erottamaan klopidogreeli- ja gemfibrotsiiliglukuronidien aiheuttamaa mekanismiin perustuvaa CYP2C8:n estovaikutusta. Ihmisen maksamikrosomeissa estovaikutus tuli näkyviin. Rekombinantti-CYP2C8-valmisteiden käyttö MBI-vaikutuksen seulomiseen saattaa täten aiheuttaa vääriä negatiivisia tuloksia. Maksamikrosomien käyttö MBI:n seulonnassa on suositeltavaa. Uusi automatisoitu in vitro -seulontamenetelmä kehitettiin MBI:n tehokkaaseen ja luotettavaan havaitsemiseen. Menetelmä perustuu CYP-substraattiseoksiin ja mahdollistaa CYP1A2-, CYP2A6-, CYP2B6-, CYP2C8-, CYP2C9-, CYP2C19-, CYP2D6-, CYP2J2- ja CYP3A-estäjien samanaikaisen seulonnan. Menetelmään valittiin selektiiviset substraatit kullekin entsyymille ja substraattien väliset yhteisvaikutukset vältettiin jakamalla substraatit kahteen erilliseen seokseen. Menetelmä validoitiin tunnettuja CYP-estäjiä käyttämällä. Validoitua menetelmää käytettiin gemfibrotsiilin ja klopidogreelin glukuronidien CYP-estovaikutuksen selektiivisyyden selvittämiseen. Molemmat glukuronidit osoittautuivat erittäin selektiivisiksi CYP2C8-estäjiksi. Substraattiseosmenetelmää käytettiin lääkkeiden glukuronidimetaboliittien MBI-estovaikutuksen systemaattisen seulontaan. Seulontaan valittiin 16 glukuronidi-metaboliittia rakenteen, MBI potentiaalin ja/tai glukuronidin plasmapitoisuuden perusteella. Seitsemän glukuronidia esti CYP-entsyymejä aikariippuvaisesti. Näistä karvediloli-β-D-glukuronidi aiheutti voimakkaimman estovaikutuksen. Jatkotutkimukset paljastivat, että kanta-aine karvediloli on voimakkaampi CYP3A-estäjä kuin karvediloliglukuronidi. Karvediloli ja diklofenaakkiasyyli-β-D-glukuronidi osoittautuvat CYP3A:n mekanismiin perustuviksi estäjiksi, jotka saattavat aiheuttaa yhteisvaikutuksia CYP3A:n välityksellä metaboloituvien lääkkeiden kanssa. In silico -mallinnuksessa karvedilolin ennustettiin aiheuttavan kliinisesti merkittäviä yhteisvaikutuksia midatsolaamin ja simvastatiinin kanssa. Ennuste on linjassa sydänlääke karvedilolin ja hyljinnänestolääke siklosporiinin välisen aikaisemmin raportoidun kliinisen yhteisvaikutuksen kanssa. Tämän väitöskirjan tutkimukset laajentavat ymmärrystä glukuronidien aiheuttamsta CYP-inaktivaatiosta ja tarjoavat metodologisia parannuksia mekanismiin perustuvien CYP-estäjien seulontaan. Uusien glukuronidirakenteisten mekanismiin perustuvien CYP-estäjien löytyminen korostaa tarvetta tunnustaa myös lääkkeiden aineenvaihduntatuotteiden merkitys lääkkeiden yhteisvaikutusten arvioinnissa. Tässä työssä kehitetty automatisoitu seulontamenetelmä tarjoaa arvokkaan työkalun CYP-estovaikutuksen varhaiseen seulontaan ja siten tarkempia ennusteita lääkkeiden yhteisvaikutuksista elävässä elimistössä.application/pdfengJulkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.Publikationen är skyddad av upphovsrätten. Den får läsas och skrivas ut för personligt bruk. Användning i kommersiellt syfte är förbjuden.kliininen farmakologiaURN:ISBN:978-952-84-1543-5ArtikkeliväitöskirjafulltextDoctoral Programme in Drug ResearchLääketutkimuksen tohtoriohjelmaDoktorandprogrammet i läkemedelsforskning3111 Biolääketieteet3111 Biomedicinska vetenskaper3111 Biomedicine3121 Yleislääketiede, sisätaudit ja muut kliiniset lääketieteet3121 Allmänmedicin, inre medicin och annan klinisk medicin3121 General medicine, internal medicine and other clinical medicine