Maatalous- metsätieteellinen tiedekunta

A multifaceted study of Propionibacterium freudenreichii, the food-grade producer of active vitamin B12

Sun, 11 Jun 2017 00:00:00 GMT

A multifaceted study of Propionibacterium freudenreichii, the food-grade producer of active vitamin B12 Deptula, Paulina Vitamin B12 is the most complex vitamin in existence and one of the most complex non-polymeric molecules occurring in nature. It is predominantly present in animal-derived products, which places vegetarians and people with limited access to animal-derived foods at risk for developing vitamin B12 deficiency. With the current trend of limiting the consumption of foods of animal origin, the deficiency may also affect other populations. In situ fortification of foods through microbial fermentation with food-grade bacteria is a viable method for the introduction of vitamin B12 into foods, if the microorganism is capable of synthesising the active vitamin form. Here, the capability of Propionibacterium freudenreichii to produce active vitamin B12 was explored with the use of a combination of microbiological and molecular approaches. First, the activity of the heterogolously expressed and purified enzyme BluB/CobT2 was investigated. The results showed that the novel fusion enzyme was responsible for biosynthesis of 5,6-dimethylbenzimidazole (DMBI) base and its activation for attachment as the lower ligand of vitamin B12. The enzyme’s inability to activate adenine, the lower ligand of pseudovitamin B12, revealed a mechanism favouring production of active vitamin B12 in P. freudenreichii. The in vivo study showed that formation of DMBI is oxygen dependent as no vitamin B12 was produced under strictly anaerobic atmosphere. Exogenous DMBI was incorporated into the vitamin molecule under both microaerobic and anaerobic conditions, with a clear preference over incorporation of adenine. In the following study, the capability of 27 P. freudenreichii and 3 Acidipropionibacterium acidipropionici strains to produce active vitamin B12 was examined by UHPLC. The yields obtained from growth in whey-based medium enriched in cobalt and supplemented with either DMBI, with the precursors of DMBI- riboflavin and nicotinamide, or without supplementation. A. acidipropionici strains required supplementation of DMBI to produce small amounts of active vitamin B12 (<0.2 µg/mL), while all of the P. freudenreichii strains were able to produce active vitamin B12 in all conditions tested. The yields of active vitamin B12 produced by P. freudenreichii and responses to supplementation were strain dependent and ranged from 0.2 to 5.3 µg/mL. Subsequently, the active vitamin B12 production by the strain P. freudenreichii 2067 without addition of cobalt or DMBI was tested. The experiments were performed in a medium mimicking cheese environment as well as in the whey-based medium. The production of other key metabolites was examined by HPLC, while the global protein production was compared by gel-based proteomics. The results showed that regardless of different effects of the media on the metabolic state of the cells, which was reflected by distinct metabolite and protein production patterns, P. freudenreichii produced nutritionally relevant levels of active vitamin B12. Finally, whole genome sequencing was employed to better characterise the species through a comparative genomics study. The use of PacBio sequencing platform, a PCR-free method producing long reads, resulted in discovery of additional circular elements: two novel, putative conjugative plasmids and three active, lysogenic bacteriophages. The long reads also permitted characterisation and classification of two distinct types of CRISPR-Cas systems. In addition, the use of PacBio sequencing platform allowed for identification of DNA modifications, which led to characterisation of Restriction-Modification systems together with their recognition motifs, many of which were reported for the first time. Genome mining suggested surface piliation in the strain P. freudenreichii JS18, which was confirmed by transmission electron microscopy and assessment of specific mucus binding.; B12-vitamiini on rakenteeltaan vitamiineista monimutkaisin, ja sitä saadaan pääasiassa eläinperäisistä tuotteista. Kasvisruokavaliota noudattavilla ja vain vähän eläinperäisiä elintarvikkeita syövillä on riski kärsiä B12-vitamiinin puutoksesta. Kasvisruokavalion suosion kasvaessa voimakkaasti ja samalla eläinperäisten tuotteiden kulutuksen laskiessa yhä suuremmat väestöryhmät voivat altistua liian vähäiselle B12- vitamiinin saannille. Elintarvikekelpoisten, ihmiselle aktiivista B12-vitamiinimuotoa tuottavien mikrobien hyödyntäminen elintarvikkeiden valmistuksessa on lupaava menetelmä B12-vitamiinin rikastamiseksi kasviperäisiin tuotteisiin joissa sitä ei tällä hetkellä ole. Tässä tutkimuksessa selvitettiin mikrobiologian ja molekyylibiologian menetelmiä hyödyntäen Propionibacterium freudenreichii -bakteerin kykyä tuottaa ihmiselle aktiivista B12-vitamiinia. Tulokset osoittivat, että P. freudenreichii –bakteeri tuottaa elintarvikeolosuhteissa ihmiselle aktiivista B12-vitamiinimuotoa ja sitä voidaan hyödyntää vitamiinin rikastamisessa elintarvikkeisiin. 18 uuden genomisekvenssin määrittäminen ja paljasti paljon uutta tietoa P. freudenreichii -lajista ja loi hyvän perustan jatkotutkimuksille.

Microbially-induced corrosion of carbon steel in a geologic repository environment

Sun, 25 Jun 2017 00:00:00 GMT

Microbially-induced corrosion of carbon steel in a geologic repository environment Rajala, Pauliina Low- and intermediate-level radioactive waste (LLW/ILW) is produced during the operation and decommission of nuclear power plants. At the Olkiluoto power plant, LLW/ILW is disposed of in an underground repository excavated into the bedrock 60–100 m below sea level. The metallic portion of this waste is typically made of carbon steel and stainless steels. In anoxic conditions, such as the groundwater at the Olkiluoto repository site, carbon steel corrosion rate is very slow unless the groundwater is highly acidic or microbial activity is high, altering local conditions to corrosion inducing direction. Microorganisms are able to accelerate general corrosion as well as induce localized corrosion forms and stress corrosion cracking as conditions under the biofilm can differ markedly from those in the adjacent environment. Critically, corrosion of metallic waste can release radioactive nuclides into the groundwater and threaten the long-term integrity of the storage site. The objective of this research was to determine the importance of microbially- induced corrosion (MIC) of carbon steel placed in deep geological repository containing LLW/ILW. The structure and function of microbial communities in the deep biosphere are still poorly understood but could have important consequences for the long-term storage of radioactive waste in underground repositories. MIC of carbon steel in anoxic groundwater was studied in the laboratory and in situ in experiments with exposure time ranging from 3 months to 15 years. MIC was examined using gravimetric and electrochemical techniques complemented by molecular biology and surface characterization methods. It was shown that conditions beneath the microbial biofilm accelerated corrosion rate of carbon steel, especially localized corrosion, and that microbial activity in deep groundwater is enhanced by the presence of carbon steel. Naturally- occurring microorganisms in deep groundwater environments have a great affinity for the surface of carbon steel and rapidly form a biofilm. Phylum proteobacteria, beta- or deltaproteobacteria depending on the experiment, were in the majority in the biofilm forming bacterial community. Archaeal biofilm was formed by phylas Euryarchaeota (DHVE) and Thaumarcheota (MBGB). However, corrosion was inhibited in concrete-encased environments, due to high alkalinity and calcium carbonate concentration in the environment. In many cases, LLW/ILW repositories contain concrete materials, which according to the present results hinders the corrosion at least in the beginning of repository time scale.; dinvoimalaitoksen käytön ja purkamisen yhteydessä syntyy radioaktiivisesti kontaminoitunutta materiaalia, joka luokitellaan aktiivisuustason perusteella pääosin matala- ja keskiaktiiviseksi radioaktiiviseksi jätteeksi. Olkiluodon ydinvoimalassa tämä jäte sijoitetaan maanalaiseen loppusijoitustilaan 60-100 m maanpinnan alapuolelle. Metallinen matala- ja keskiaktiivinen jäte on pääosin hiiliterästä ja ruostumattomia teräksiä. Hapettomissa olosuhteissa, kuten pohjavesi Olkiluodon loppusijoitustilassa, hiiliteräksen korroosionopeus on hyvin matala, ellei pohjavesi ole hyvin hapanta tai mikrobiologinen toiminta ole aktiivista, muuttaen paikallisia olosuhteita korroosiota kiihdyttäviksi. Mikrobit voivat kiihdyttää teräksen yleistä korroosiota sekä edesauttaa paikallisen ja jännityskorroosion syntymistä luomalla biofilmin alle korroosiolle altistavat olosuhteet, jotka voivat merkittävästi erota ympäröivistä olosuhteista. Metallisen radioaktiivisen jätteen korroosio voi vaikuttaa radionuklidien kulkeutumiseen sekä vaikuttaa loppusijoituksen pitkäaikaisturvallisuuteen. Tämän tutkimuksen tavoite oli kartoittaa hiiliteräksen mikrobiologisen korroosion riskejä loppusijoitusolosuhteissa. Mikrobiyhteisön koostumus ja toiminnallisuus syvässä kallioperässä on yhä heikosti tunnettua, mutta sillä saattaa olla vaikutusta vaikuttaa matala- ja keskiaktiivisen jätteen loppusijoituksen pitkäaikaisturvallisuuteen. Mikrobiologista korroosiota hapettomassa pohjavedessä on tutkittu sekä laboratorio- että in situ -olosuhteissa koeaikojen ollessa kolmesta kuukaudesta viiteentoista vuoteen. Mikrobiologista korroosiota tutkittiin sekä painohäviöön perustuvilla että sähkökemiallisilla menetelmillä yhdistettynä molekyylibiologisiin menetelmiin ja pinnan karakterisointiin. Tulokset osoittavat, että mikrobien muodostaman biofilmin alla syntyi olosuhteet, joissa hiiliteräksen korroosio, erityiseesti paikallinen korroosio, merkittävästi kiihtyi. Tulokset myös osoittivat, että pohjaveden mikrobiyhteisö hyötyi hiiliteräksestä. Pohjaveden luonnollinen mikrobiyhteisö hakeutui hiiliteräksen pinnoille muodostaen nopeasti biofilmiä. Proteobacteria pääjaksoon kuuluvat bakteerit, beta- tai deltaproteobacteria riippuen koeolosuhteista, olivat suurimmassa osassa biofilmin bakteeriyhteisöä. Biofilmin arkeoniyhteisön muodostivat pääjaksojen Euryarchaeota (DHVE) ja Thaumarcheota (MBGB) arkeonit. Koesarjoissa, jotka suoritettiin betonin läsnäollessa, korroosionopeus oli huomattavasti matalampi, johtuen korkeasta pH:sta ja kalsiumkarbonaatti-pitoisuudesta. Matala- ja keskiaktiivisen jätteen loppusijoitusolosuhteissa käytetään betonirakenteita, jotka näiden tulosten pohjalta voivat hidastaa korroosiota ainakin loppusijoituksen alkuvaiheessa.

Integrating mechanistic disturbance models and stand dynamics of Norway spruce

Tue, 06 Jun 2017 00:00:00 GMT

Integrating mechanistic disturbance models and stand dynamics of Norway spruce Honkaniemi, Juha Disturbances, caused by abiotic and biotic agents, are discrete events in time disrupting the ecosystem and resulting in the reduction of plant biomass. They play a key role in forest ecosystems, but in the managed forests pose a risk to forest productivity. The projected climate change is expected to increase the risk of various disturbances in the boreal forests. In Europe, the major risks threatening the Norway spruce (Picea abies) dominated stands are caused by Heterobasidion root rot, wind storms, and European spruce bark beetle (Ips typographus). Heterobasidion root rot causes growth losses, mortality and decreases the timber quality. It also decreases the mechanical stability of the tree against wind load and increases the stand vulnerability for wind damages. Bark beetles benefit from the low resistance breeding material, i.e., wind damaged trees, when the population is low and can emerge as outbreaks in the right conditions. This thesis presents a simulation framework WINDROT to simulate the interactive dynamics of these disturbance agents. WINDROT consists of four simulation models, each responsible for either the dynamics of the host or one of the disturbance agents. A stand level decision support system, MOTTI, simulates the growth and dynamics of tree stands as affected by forest management, and provides inputs for mechanistic models Hmodel, HWIND and BBDYN simulating the dynamics and effects of disturbance agents. The model performance analyses in tree and stand scale showed that; i) the Heterobasidion dynamics are driven by primary and secondary infections on large stumps; ii) increasing intensity of Heterobasidion root rot damages increases the risk for wind damages; and iii) the increasing wind damages increased the subsequent bark beetle damages. The simulation framework can be used to analyze the sensitivity of different forest management regimes to the risks posed by these damages alone and in various combinations.; Erilaiset abioottiset ja bioottiset häiriöt, kuten myrskyt tai sienitaudit, kuuluvat merkittävänä osana metsäekosysteemin toimintaan. Ne ovat satunnaisia ja lyhytkestoisia tapahtumia, jotka muuttavat metsäekosysteemiä usein merkittävästi. Kasvatusmetsissä muutamien puiden kuolema on osa luonnon kiertokulkua, mutta isoja häiriöitä pidetään metsätuhoina, sillä aiheuttavat merkittävän riskin metsänkasvatuksen kannattavuudelle. Ilmastonmuutoksen ennustetaan lisäävän metsätuhoriskiä erityisesti pohjoisen pallonpuoliskon boreaalisissa metsissä. Euroopassa merkittävimmän tuhoriskin kuusivaltaisille metsille (Picea abies) aiheuttavat juurikääpä (Heterobasidion annosum s.l.), tuuli ja kirjanpainaja (Ips typographus). Juurikääpä lahottaa puiden juuristo ja taloudellisesti arvokasta runkopuuta aiheuttaen kasvutappioita, kuolleisuutta sekä vähentäen puutavaran arvoa. Lisäksi puiden mekaaninen vastustuskyky tuulta vastaan heikkenee lahon myötä ja lisää metsiköin alttiutta tuulituhoille. Tuulituhopuista hyötyvät kirjanpainajat, jotka pystyvät voittamaan jo valmiiksi heikentyneiden puiden puolustuskyvyn terveitä puita helpommin. Kirjanpainajat hyötyvät heikentyneistä puista erityisesti silloin, kun niiden kanta on pieni. Suotuisissa olosuhteissa ne voivat aiheuttaa massiivisiakin tuhoja. Väitöskirjan aiheena on näiden kolmen edellä mainitun tuhonaiheuttajan kehityksen ennustaminen mekanististen mallien avulla. Mallit on liitetty metsikön kasvua ja dynamiikkaa kuvaavaan ohjelmistoon, jonka avulla voidaan tarkastella tuhoriskejä metsikkötasolla erilaisissa skenaarioissa. Näistä malleista on väitöskirjassa luotu WINDROT-mallikonaisuuden, jonka avulla voidaan ensimmäistä kertaa simuloida eri tuhoaiheuttajien välisiä yhdysvaikutuksia. WINDROT-mallikokonaisuudessa MOTTI-ohjelmisto simuloi metsikön kasvua ja rakennetta ottaen huomioon metsänhoidon. Hmodel-, HWIND- ja BBDYN -mallit simuloivat kukin yhden tuhonaiheuttajan kehitystä metsikkötasolla. Väitöskirjan osatutkimuksissa esitellään mallien rakennetta sekä tarkastellaan puu- ja metsikkötasolla mallikokonaisuuden toimintaa. Tulokset osoittivat, että: i) juurikäävän dynamiikkan merkittävin tekijä ovat itiö- ja juuristotartunnat suuriin kantoihin, ii) juurikäävän määrä metsikössä vaikuttaa merkittävästi metsikön tuulituhoriskiin; sekä iii) tuulituhojen määrä vaikutti niitä seuraaviin kirjanpainajatuhoihin. Metsätuhot ovatkin siis vaikutuksissa vahvasti toisiinsa ja niitä tulisi tarkastella yhtenä kokonaisuutena. Mallikokonaisuutta voidaan jatkossa käyttää erilaisten metsänkasvatusketjujen riskiarviointiin sekä tarkastella tuhoriskejä muuttuvissa tilanteissa. Merkittävä sovellusmahdollisuus on erilaisten torjuntakeinojen vertailu tuhoriskien hallinnassa.

Genetics of longitudinal growth data

Tue, 09 May 2017 00:00:00 GMT

Genetics of longitudinal growth data Coyne, Jessica M. The objective of this thesis was threefold: 1) to compare alternative growth functions fitted to pig live-weight data, with particular emphasis on the ability of the growth function to predict live-weight; 2) to estimate genetic (co)variances for the parameters of the previously determined most appropriate growth function using alternative modelling approaches; 3) to estimate genetic (co)variance parameters pertaining to live-weight, feed intake and two other efficiency traits using Legendre polynomial equations. The final dataset used included 51,893 live-weight and 903,436 feed intake records from 10,201 pigs obtained from the Finnish pig breeding company Figen Oy. Fixed effects and mixed models were applied to three different growth functions, namely von Bertalanffy, Gompertz, and Richards; fixed and mixed model polynomial equations were also considered. Each growth function’s ability to predict future live-weight was determined by excluding a selection of animal live-weight records post 160 days of age, and comparing the predicted live-weight to actual live-weight. The accuracy of fit for each model was determined as the square of the correlation between the actual and predicted weights. The root mean square error (RMSE) values for each model scenario were also estimated. The Gompertz growth function achieved the greatest accuracy squared of modelling pig live-weight (0.997) and lowest RMSE (1.60 kg). When used in a mixed model framework the Gompertz growth function also achieved the greatest accuracy squared of predicting future live-weight records (0.846) with the lowest corresponding RMSE (5.35 kg). Based on the results from the first study the Gompertz growth function was used to estimate the genetic (co)variance of the function’s parameters asymptotic mature weight (A), the logarithm of the ratio of mature weight to birth weight (B) and rate of maturation (k). Three alternative approaches were utilised to estimate the variances; a two-step fixed effects approach, a two-step mixed model approach and a one-step mixed model approach. The two-step approach initially used growth function parameter estimates from the first study (paragraph above) and subsequently estimated the variance component parameters for A, B and k, using a linear mixed model; whereas, the one-step approach used an iterative method to calculate the variance component estimates for the growth function parameters, in a mixed model framework. Results from this genetic analysis highlighted that ample genetic variation exists for all three Gompertz growth function parameters; greater heritability estimates for the Gompertz growth function parameters were obtained from the one-step mixed model approach. Genetic (co)variances for live-weight, feed intake and two efficiency measures, namely residual feed intake and residual daily gain, were estimated using random regression Legendre polynomial models. Results using the random regression Legendre polynomial models showed heritability of live-weight, feed intake, residual feed intake and residual daily gain increased in the early growing phase, peaked and subsequently decreased as the age of the animal increased. Ample genetic variation existed for all four traits, indicating the potential to alter curve profiles to meet specific breeding objectives. Results from this thesis can be implemented into genetic evaluations for pigs, providing comprehensive information on the profile of growth and efficiency throughout the growing period of the animal’s life, thus helping breeders identify genetically superior animals.; Opinnäytetyön tavoitteena oli: 1) vertailla sikojen elopainoaineistoon sovitettuja vaihtoehtoisia kasvufunktioita kiinnittäen erityisesti huomio funktion kykyyn ennustaa tulevaa elopainoa, 2) arvioida aiemmin määritellyn parhaaseen kasvufunktioon perustuvia perinnöllisiä variansseja ja kovariansseja käyttämällä vaihtoehtoisia mallintamismenetelmiä, ja 3) arvioida elopainon, syöntikyvyn, jäännössyönnin ja jäännöspäiväkasvun perinnöllisiä variansseja ja kovariansseja käyttäen Legendre -polynomiyhtälöitä. Aineistossa, joka saatiin suomalaiselta Figen Oyltä, oli 51 893 elopaino- ja 903 436 syöntihavaintoa 10 211 sialta vuosilta 2006 - 2012. Sekamallit ja kiinteiden tekijöiden mallit sovitettiin kolmelle eri kasvufunktiolle, jotka olivat von Bertalanffy, Gompertz ja Richards. Myös kiinteitä ja sekamallimuotoisia polynomiyhtälöitä tarkasteltiin. Jokaisen kasvufunktion kyky ennustaa tulevaa elopainoa määritettiin poistamalla valittu joukko elopainoja 160 päivän iästä lähtien ja vertaamalla ennustettua elopainoa punnittuun elopainoon. Kunkin mallin tarkkuus määritettiin punnitun ja ennustetun painon välisen korrelaation neliönä. Kullekin mallille arvioitiin myös keskineliövirheen neliöjuuri (RMSE). Gompertzin kasvufunktio saavutti suurimman tarkkuuden sikojen elopainojen mallintamisessa (0,997) ja sillä oli myös alin RMSE (1,60 kg). Gompertzin kasvufunktiolla oli sekamallissa suurin tarkkuus ennustettaessa tulevia elopainoja (0.846) ja myös pienin vastaava RMSE (5.35 kg). Ensimmäisen tutkimuksen tulosten perusteella päätettiin arvioida perinnölliset varianssit ja kovarianssit Gompertzin kasvufunktion kertoimille: asymptoottinen aikuispaino (A), logaritminen syntymä- ja aikuispainon suhde (B) ja aikuistumissuhde (k). Varianssien arvioinnissa käytettiin kolmea vaihtoehtoista lähestymistapaa: kaksivaiheinen kiinteiden tekijöiden arviointiin perustuva, kaksivaiheinen sekamalliin perustuva ja yksivaiheinen sekamalliin perustuva lähestymistapa. Kaksivaiheinen lähestymistapa käytti ensimmäisessä tutkimuksessa arvioituja kasvufunktion kertoimia (kuvattu edellisessä kappaleessa) joiden avulla edelleen arvioitiin varianssikomponentit A:lle, B:lle ja k:lle käyttäen lineaarista sekamallia. Yksivaiheisessa lähestymistavassa taas käytettiin iteratiivista menetelmää, jolla laskettiin varianssikomponenttienestimaatit kasvufunktion kertoimille sekamallilla. Kaksivaiheisesta kiinteiden tekijöiden mallista tai sekamallista, tai yksivaiheisesta sekamallista saadut tulokset näyttivät, että kaikilla Gompertzin kasvufunktion kertoimilla on runsaasti perinnöllistä vaihtelua: Gompertzin kasvufunktion kertoimien suurimmat periytymisasteet saatiin yksivaiheisella sekamallilla. Perinnölliset varianssit ja kovarianssit elopainolle, rehun syöntikyvylle, jäännössyönnille ja jäännöspäiväkasvulle laskettiin käyttäen Legendre–polynomeihin perustuvia satunnaisregressiomalleja. Tulokset osoittivat, että elopainon, rehun syöntikyvyn, jäännössyönnin ja jäännöspäiväkasvun periytymisaste suureni aikaisessa kasvun vaiheessa, saavutti korkeimman arvonsa ja pieneni eläimen vanhetessa. Kaikissa neljässä ominaisuudessa oli runsaasti geneettistä vaihtelua, mikä viittaa siihen, että jalostusvalinnalla pystytään muuttamaan kasvukäyräprofiileja vastaamaan erityisiä kasvatustarpeita. Tämän opinnäytetyön tuloksia voidaan hyödyntää sikojen koko kasvatusjakson aikaisen kasvun ja tehokkuuden profiilin perinnöllisissä arvosteluissa auttaen kasvattajia tunnistamaan perinnölliseltä tasoltaan hyvät eläimet.