Micronuclei in Human peripheral Lymphocytes : Mechanistic Origin and Use as a Biomarker of Genotoxic Effects in Occupational Exosure

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-261-440-7
Title: Micronuclei in Human peripheral Lymphocytes : Mechanistic Origin and Use as a Biomarker of Genotoxic Effects in Occupational Exosure
Author: Falck, Ghita
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Department of Biosciences, Perinnöllisyystiede
Työterveyslaitos, Terveys ja työkyky osaamiskeskus, Systeemitoksikologia tiimi
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2014-08-29
Language: en
Belongs to series: URN:ISSN:1237-6183
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-261-440-7
http://hdl.handle.net/10138/135686
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: The formation of micronuclei (MN) in peripheral blood lymphocytes represents one of the earliest cytogenetic effects of exposure to genotoxic carcinogens. An increased frequency of MN and of other cytogenetic alterations, such as chromosomal aberrations and sister chromatid exchanges, in a well-controlled study of occupationally exposed people, is usually considered a strong indication of exposure to genotoxic carcinogens, requiring improvements in protective measures. Such considerations are further supported by epidemiological studies, suggesting that a high frequency of chromosomal aberrations and MN is predictive of an increased risk of cancer. This study was performed to obtain comprehensive information about the suitability of the lymphocyte micronucleus assay (MN assay) in examining the effects of occupational exposure to genotoxic carcinogens. MN, defined as small, additional nuclei, are formed in mitosis from acentric chromosomal fragments or chromosomes that lag behind in anaphase and eventually fail to be included in either of the daughter nuclei. The primary objectives of this dissertation were to clarify factors affecting the mechanistic origin of MN and to assess the influence of some methodological aspects in the MN assay. The differentiation of MN harbouring fragments from those containing whole chromosomes was considered a main goal, in order to estimate whether these two classes of MN should be analyzed separately. Methodologically, the influence of cell culture time and the use of the cytokinesis-block method on the frequency and contents of MN were assessed, as well as the possibility to analyze MN in vivo from uncultured T-lymphocytes. In addition, the suitability of bromodeoxyuridine (BrdU) labeling as an alternative method to the cytokinesis-block technique was investigated in greenhouse workers occupationally exposed to pesticides. Furthermore, some genetic polymorphisms (GSTM1, GSTT1 and NAT2) were also studied in the greenhouse workers to reveal their possible role as modifiers of individual response to the occupational exposure. Finally, mechanistic aspects concerning the formation of MN from chromosomes and fragments lagging behind in anaphase, with a special reference to the X chromosome, were assessed. By using pancentromeric fluorescence in situ hybridization (FISH), considerable proportions of MN were found to contain whole chromosomes or chromatids. The frequency of this type of MN was both age- and culture-time-dependent. Micronucleus analysis using the anti-BrdU staining technique showed that the pesticide-exposed greenhouse workers, in particular exposed smokers, had a higher micronucleus frequency than their respective controls. Subjects with the GSTM1 positive and NAT2 fast acetylator genotypes had higher frequencies of MN, but this effect was not related to the pesticide exposure. Comparison of the proportion of various types of MN in cultured and uncultured T-lymphocytes of women, using a pancentromeric and a centromeric X-chromosome specific DNA probe, indicated that in vivo MN in T-lymphocytes primarily consist of whole chromosomes, especially the X-chromosome. In general, the X chromosome was highly over-represented in female MN, and cell culture further increased the frequency of X-chromosome-positive MN. The high micronucleation of the X-chromosome appeared to be due to its frequent lagging behind in anaphase. Reciprocal chromosome gain and loss in lymphocytes was more common for the X-chromosome both in men and women than for the Y-chromosome in men. The results of this dissertation strongly suggest that, when MN are used as a biomarker of human genotoxic effects, the recognition of the contents of MN is of utmost importance and is expected to improve the specificity and sensitivity of the assay. Furthermore, the direct analysis of MN in uncultured peripheral T lymphocytes, combined with centromeric FISH, may provide a new possibility for the assessment of chromosome breakage and numerical chromosome alterations occurring in vivo.Mikrotumien lisääntyminen perifeerisen veren lymfosyyteissä on ensimmäisiä sytogeneettisiä vaikutuksia altistuttaessa genotoksisille, syöpää aiheuttaville genotoksisille tekijöille. Työntekijöillä tehdyissä, tutkimuksissa mikrotumien ja muiden sytogeneettisten muutosten kuten kromosomiaberraatioiden ja sisarkromatidivaihdosten määrän kohoamista kontrolliryhmään verrattuna pidetään selkeänä osoituksena altistumisesta genotoksisille karsinogeeneille ja perusteena korjaaville toimenpiteille. Tätä näkemystä tukevat epidemiologiset tutkimukset, jotka ovat osoittaneet, että kromosomiaberraatioiden ja mikrotumien määrän lisääntyminen ennakoi kohonnutta syöpäriskiä. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli saada uutta tietoa lymfosyyttien mikrotuma-analyysin käyttökelpoisuudesta tutkittaessa työperäistä altistumista genotoksisille karsinogeeneille. Mikrotumat ovat pieniä, ylimääräisiä tumia, joita muodostuu, kun kromosomifragmentit tai kokonaiset kromosomit jäävät tuman jakautuessa jälkeen muista kromosomeista eivätkä kulkeudu tytärtumiin. Tämän väitöskirjan päätavoitteena oli selventää mikrotumien syntymekanismeja ja eräiden menetelmällisten tekijöiden merkitystä mikrotuma-analyysissä. Keskeinen päämäärä oli erottaa fragmentteja sisältävät mikrotumat kokonaisia kromosomeja sisältävistä mikrotumista, jotta voitaisiin arvioida, tulisiko näitä mikrotumien pääryhmiä tarkastella erikseen. Menetelmällisistä kysymyksistä keskityttiin selvittämään, miten lymfosyyttien viljelyaika ja sytokineesiblokki-menetelmän käyttö vaikuttavat mikrotumien sisältöön ja esiintymistiheyteen ja voidaanko mikrotumia tutkia T-lymfosyyteistä ilman soluviljelyä. Lisäksi pestiseideille työperäisesti altistuneilla kasvihuonetyöntekijöillä tutkittiin mahdollisuutta käyttää sytokineesiblokki-menetelmän sijasta bromodeoksiuridiini (BrdU) -leimausta vaihtoehtoisena metodina. Työntekijöiltä tutkittiin myös, vaikuttaako eräiden vierasaineenvaihduntaan liittyvien geenien (GSTM1, GSTT1 ja NAT2) geneettinen monimuotoisuus henkilökohtaiseen mikrotumavasteeseen työperäisessä altistumisessa. Lopuksi selvitettiin, miten mikrotumia muodostuu tuman jakautumisen aikana jälkeen jäävistä kokonaisista kromosomeista ja kromosomien fragmenteista. Kun mikrotumien sisältöä tutkittiin fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) -menetelmällä, valtaosan mikrotumista havaittiin sisältävän kokonaisia kromosomeja tai kromatideja. Tämän tyyppisten mikrotumien esiintymistiheys lisääntyi iän ja viljelyajan myötä. Käyttämällä antibromodeoksiuridiini-värjäystekniikkaa osoitettiin, että pestisideille altistuneilla kasvihuonetyöntekijöillä, erityisesti altistuneilla tupakoitsijoilla, oli korkeampi mikrotumafrekvenssi kuin kontrollihenkilöllä. GSTM1-positiivinen genotyyppi ja nopean asetylaation NAT2-genotyyppi liittyivät korkeaan mikrotumafrekvenssiin, mutta niillä ei ollut yhteisvaikutuksia pestisidialtistumisen kanssa. Kun T-lymfosyyttien mikrotumien sisältöä tutkittiin käyttäen pansentromeeristä ja X-kromosomin sentromeerin DNA-koetinta ennen soluviljelyä ja sen jälkeen, ilmeni, että in vivo -mikrotumat sisältävät pääosin kokonaisia kromosomeja. Erityisesti X-kromosomi oli selvästi yliedustettuna tutkittujen naisten mikrotumissa, ja solujen viljely lisäsi vielä X-kromosomin sisältävien mikrotumien esiintymistiheyttä. X-kromosomin yleisyys mikrotumissa näytti selittyvän sillä, että X-kromosomi jää odotettua useammin jälkeen muista kromosomeista tuman jakautumisen anafaasi-vaiheessa. X kromosomin virheellinen segregaatio tytärtumien välillä oli odotettua yleisempää sekä naisilla että miehillä, ja miehillä virhe koski useammin X-kromosomia kuin Y-kromosomia. Väitöskirjan tulos viittaa vahvasti siihen, että mikrotumien sisällön tunnistaminen on erityisen tärkeää menetelmän spesifisyyden ja herkkyyden kannalta, kun mikrotuma-analyysiä käytetään genotoksisen vaikutuksen biomarkkerina työntekijätutkimuksissa. T-lymfosyyttien suora analyysi ilman soluviljelyä yhdistettynä pansentromeeriseen FISH:iin tarjoaa uuden mahdollisuuden mitata kromosomikatkoksista ja kokonaisista kromosomeista in vivo syntyneiden mikrotumien esiintymistiheyttä.
Subject: perinnöllisyystiede
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
micronuc.pdf 1.213Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record