Label-free imaging of cells and particle interactions based on coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS)

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151266
Title: Label-free imaging of cells and particle interactions based on coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS)
Author: Saarinen, Jukka
Other contributor: Helsingin yliopisto, Farmasian tiedekunta
University of Helsinki, Faculty of Pharmacy
Helsingfors universitet, Farmaceutiska fakulteten
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2014
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151266
http://hdl.handle.net/10138/135853
Thesis level: master's thesis
Discipline: Farmaceutisk teknologi
Pharmacy Technology
Farmasian teknologia
Abstract: The aim of this thesis was to investigate the potential of label-free CARS microscopy as a new method for chemically-specific imaging of live cells and particle-cell interactions in a drug delivery context. Cells used to mimic the intestinal epithelium, Caco-2 cells and HT-29 cells and nano-/ microcrystal particle interactions with macrophages were studied. More information about drug absorption from intestinal and particle cell interactions are needed, since many novel drugs lack properties needed for good bioavailability. It would be beneficial if these events could be visualized without labels. CARS microscopy was found to be well suited to imaging live Caco-2 and HT-29 cells that were grown on PTFE Transwell inserts. CARS microscopy revealed lipid droplets inside these cells. The size of lipid droplets increased in Caco-2 cells a lot during a three week period so that at the end a large part of the inner part of the cell was filled with lipid droplets. It was also observed that Caco-2 cells and HT-29 cells can grow on top of each other on Transwell inserts and not just as a monolayer. These two facts could cause variations in drug absorption studies based on Caco-2 cell monolayers. CARS microscopy was able to detect nanocrystals as small as about 500 nm with label-free, molecular-specific CARS microscope inside RAW 264.7 macrophages after incubation of 120 min. This observation was important, since nanocrystal drug formulations are gaining interest in the field of pharmacy. Nanocrystals can be used in parenteral drug formulations as well as in oral dosage forms. In suspensions, nanocrystals can be used to cause long lasting drug release. Nanocrystals can be also used to enhance poor bioavailability of drugs. Whether these nanocrystals are used in parenteral formulations or in oral drug formulations it is evident that imaging techniques are needed to image interactions between these nanocrystals and cells. CARS microscopy could be one of those techniques, since it is suitable for live cell imaging and it can be used to image nanocrystals that are not labeled. The results in this thesis suggest that CARS microscopy could be used as fast imaging technique for nanocrystal particle cell interactions. Overall, CARS microscopy is a relatively new imaging method that shows much promise as a label-free chemically specific imaging technique for imaging cells and cell-particle interactions in a drug delivery context. As the technique becomes more widely available and undergoes some technical developments, it will become much more widespread imaging method in the future.Tämän työn tarkoituksena oli tutkia, miten hyvin CARS-mikroskooppia voidaan käyttää kuvaamaan eläviä soluja ilman väriaineita. Caco-2 ja HT-29 soluja, joita tavallisesti käytetään mallintamaan ohutsuolen epiteelisolukkoa käytettiin mallina. Lisäksi tarkoituksena oli saada tietoa kuinka hyvin CARS- mikroskooppia voidaan käyttää kuvaamaan nano-/mikrokidehiukkasten vuorovaikutuksia makrofagisolujen kanssa. Olisi hyödyllistä, jos näitä tapahtumia pystyttäisiin kuvantamaan ja näistä tapahtumista saataisiin lisätietoa sillä, monet uudet lääkeaineet imeytyvät huonosti ohutsuolesta. Osoittautui, että CARS- mikroskopia soveltuu hyvin elävien Caco-2 ja HT-29 solujen kuvaamiseen kuoppalevyillä PTFE Transwell inserttien päällä, jossa nämä solut kasvavat yhden solukerroksen paksuiseen kerrokseen. Solujen sisältä paljastui lipidi pisaroita (lipid droplets). Caco-2 soluissa nämä pisarat kasvoivat kolmen viikon tarkastelujakson aikana paljon. Lopulta iso osa solun siällöstä saattoi olla näitä lipidi pisaroita. CARS- mikrskoopilla kuvattuna paljastui myös, että nämä solut eivät kasva aina yhdessä kerroksessa, vaan myös päällekkäin. Nämä löydöt selittävät osaltaan lääkeaineiden imeytymiskokeiden tulosten vaihteluita. Nanokidehiukkasia pystyttiin selvästi havaitsemaan RAW 264.7 solujen sisältä CARS- mikroskoopilla ainakin 500 nm kokoluokassa kahden tunnin inkuboinnin jälkeen. Tutkimustulos, että nanokidehiukkasia voidaan kuvata ilman väriaineita CARS- mikroskoopilla on merkittävä, sillä nanokidehiukkasten käyttö farmaseuttisissa lääkevalmisteissa on lisääntymässä. Niitä voidaan käyttää esimerkiksi suspensioissa, joissa ne mahdollistavat pitkäaikaisen lääkkeen vapautumisen. Niitä voidaan mahdollisesti käyttää myös suun kautta annosteltavissa lääkemuodoissa tulevaisuudessa. Nanokidehiukkaslääkemuotojen on osoitettu parantavan uusien lääkeaineiden hyötyosuutta esimerkiksi syöpälääkkeillä, sillä niiden on osoitettu estävän effluksiproteiinien kuten P-gp proteiinin toimintaa. Oli kyseessä sitten, parenteraalinen nanokidehiukkaslääkevalmiste tai suun kautta nauttitava lääkevalmiste, kuvaamistekniikoita tarvitaan tutkimaan näiden hiukkasten ja solujen välisiä vuorovaikutuksia. CARS- mikroskopia voisi olla yksi näistä tekniikoista, koska se soveltuu elävien solujen kuvaamiseen ja sen avulla voidaan kuvata nanokidehiukkasia ilman ulkoisia väriaineita. Tämän tutkielman tulokset osoittavat, että CARS- mikroskopiaa voidaan käyttää nopeasti kuvaamaan nanokidehiukkasten ja solujen välisiä vuorovaikutuksia ja hiukkasten solun sisään kertymistä. Yhteenvetona voidaan sanoa, että CARS- mikroskopia on varteenotettava menetelmä solujen kuvaamiseen sekä lääkeainehiukkasten ja solujen välisten vuorovaikutusten kuvaamiseen ilman ulkoisia väriaineita. CARS- mikroskopian avulla voidaan tutkia lääkeaineen kulkeutumista vaikutusalueelle soluissa. Onkin varmasti, niin että CARS- mikroskopian käyttö tulevaisuudessa lisääntyy, kunhan laitteisto tulee yleisemmin saataville ja tekniikka vielä hiukan kehittyy.
Subject: CARS
Caco-2
label-free imaging
intestinal cell culture
particle uptake
microscopy
non-linear imaging
nanocrystals
kuvaaminen ilman väriaineita
ohutsuolen solumallit
hiukkasten soluun sisäänotto
epälineaarinen kuvantaminen
nanokiteet
mikroskopia


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Jukka Saarinen Master's Thesis everything OK.pdf 10.23Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record