CHARACTERIZATION OF NEUROTOXIN GENE LOCATION, TOXIGENESIS AND COLD TOLERANCE IN CLOSTRIDIUM BOTULINUM

Näytä kaikki kuvailutiedot

Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-0395-6
Julkaisun nimi: CHARACTERIZATION OF NEUROTOXIN GENE LOCATION, TOXIGENESIS AND COLD TOLERANCE IN CLOSTRIDIUM BOTULINUM
Tekijä: Zhang, Zhen
Muu tekijä: Helsingin yliopisto, eläinlääketieteellinen tiedekunta
Opinnäytteen taso: Väitöskirja (artikkeli)
Tiivistelmä: Clostridium botulinum is an infamous pathogen that produces botulinum neurotoxin, the causative agent of potentially fatal, neuroparalytic disease in humans and animals called botulism. Despite decades of research, much remains unknown regarding neurotoxin gene location, toxigenesis, and physiology of C. botulinum. First, it is unclear whether mobile genetic elements can mediate transmission of type E neurotoxin gene. Second, the regulatory circuits of botulinum neurotoxin synthesis remain largely unknown. Third, the physiological mechanism of C. botulinum cold stress tolerance is of great importance in cold chain food processing and preservation, but remains poorly understood. The aim of this study was to investigate the location of the type E botulinum neurotoxin gene, identify the potential regulators of neurotoxin synthesis in Group I C. botulinum type A1 strain ATCC 3502, and to characterize the regulon of the two-component signal transduction system (TCS) CBO0366/CBO0365 and its role in cold stress tolerance in C. botulinum ATCC 3502. A group of 36 C. botulinum type E strains was examined by pulsed-field gel electrophoresis and Southern hybridization with probes specific for type E neurotoxin gene (botE) and orfX1, a member of type E neurotoxin gene cluster. The results suggest that three C. botulinum strains encode botE and orfX1 in large plasmids of about 146 kb in size. In C. botulinum ATCC 3502, TCS CBO0787/CBO0786 was found to negatively regulate botulinum neurotoxin expression. Inactivation of cbo0787 encoding a sensor histidine kinase, or of cbo0786 encoding a response regulator, resulted in significantly elevated neurotoxin gene expression levels and increased neurotoxin production. Recombinant CBO0786 regulator was shown to bind to the conserved -10 site of the core promoters of the ntnh-botA and ha operons, which encode the toxin structural and accessory proteins. Increasing concentration of CBO0786 inhibited BotR-directed transcription from the ntnh-botA and ha promoters, demonstrating direct transcriptional repression of the ntnh-botA and ha operons by CBO0786. CodY, a global regulator conserved in low-G+C Gram-positive bacteria, was shown to positively regulate the botulinum neurotoxin gene expression. Inactivation of codY resulted in decreased neurotoxin gene expression levels and reduced neurotoxin synthesis. Complementation of the codY mutation in trans rescued neurotoxin synthesis, and overexpression of codY in trans caused elevated neurotoxin production. Recombinant CodY was found to bind to probes possessing the neurotoxin gene promoters, but strongly interacted only with a 30-bp region in the promoter of ntnh-botA operon, suggesting regulation of the neurotoxin gene transcription through direct interaction. GTP enhanced the binding affinity of CodY to the ntnh-botA promoter, suggesting CodY-dependent neurotoxin regulation is associated with nutritional status. A total of about 150 genes regulated by TCS CBO0366/CBO0365, were identified by DNA microarray. Inactivation of CBO0365 regulon genes encoding acetone-butanol-ethanol fermentation pathway, phosphate transport and arsenical resistance did not affect the growth of C. botulinum ATCC 3502 at 37 °C, but significantly impacted growth after a temperature downshift to 17 °C. These results suggest TCS CBO0366/CBO0365-regulated acetone-butanol-ethanol fermentation, phosphate transport and arsenical resistance play an important role in cold tolerance in C. botulinum ATCC 3502.Clostridium botulinum on pahamaineinen taudinaiheuttaja, joka kasvessaan tuottaa botulinumneurotoksiinia. Botulinumneurotoksiini aiheuttaa botulismina tunnettua potentiaalisesti tappavaa velttohalvausta ihmisillä ja eläimillä. Huolimatta vuosikymmenten tutkimuksesta, C. botulinumin neurotoksiinia koodaavien geenien sijainnista, bakteerin toksiinintuotosta sekä fysiologiasta tiedetään edelleen vähän. Liikkuvien geneettisten elementtien merkitys neurotoksiinigeenien siirtymisessä on epäselvää, sekä botulinumneurotoksiinin tuotannon säätelyverkostot suurelta osin tuntemattomia. Myöskään C. botulinumin kylmänsietomekanismeja, jotka ovat merkittäviä kylmäketjuun perustuvassa elintarvikkeiden säilönnässä, ei tunneta riittävästi. Tämän väitöskirjatutkimuksen tavoitteena oli kartoittaa neurotoksiinigeenien sijaintia, tunnistaa mahdollisia neurotoksiinin tuotantoa sääteleviä tekijöitä, sekä selvittää C. botulinumin kylmänsietoon vaikuttavia tekijöitä. Yhteensä 36 C. botulinum tyypin E toksiinia tuottavalta bakteerikannalta selvitettiin pulssikenttäelektroforeesin sekä Southern-hybridisaation avulla neurotoksiinia koodaavan botE-geenin sekä neurotoksiinigeeniryppääseen kuuluvan orfX1-geenin sijainti. Tutkimuksissa havaittiin näiden geenien sijaitsevan suurikokoisessa plasmidissa kolmella tutkitulla bakteerikannalla. Aiemmin karakterisoimattoman kaksoiskomponenttijärjestelmä CBO0787/CBO0786:n havaittiin säätelevän negatiivisesti neurotoksiinigeenien ilmentymistä C. botulinumilla. Järjestelmää koodaavien geenien inaktivaatio lisäsi neurotoksiinigeenien ilmentymistä sekä toksiinintuottoa. CBO0786 säätelijäproteiinin osoitettiin sitoutuvan neurotoksiinikompleksin proteiineja koodaavien operonien promoottorialueille ja suoraan estävän näiden operonien luentaa. Kyseinen järjestelmä on ensimmäinen tunnistettu botulinumneurotoksiinin tuotantoa negatiivisesti säätelevä mekanismi. Konservoituneen CodY-säätelytekijän osoitettiin positiivisesti säätelevän botulinumneurotoksiinigeenien ilmentymistä. Kyseistä säätelijää koodaavan codY-geenin inaktivaatio sammutti sekä toksiinigeenien ilmentymisen että toksiinintuoton. Kun codY-geenin toimiva kopio palautettiin bakteeriin, toksiinituotanto palautui normaalille tasolle. Lisäksi codY:n ilmentäminen ylimäärin johti entisestään lisääntyneeseen toksiinintuottoon. CodY-proteiinin havaittiin sitoutuvan neurotoksiinigeenien promoottorialueisiin, mikä osoittaa CodY:n säätelevän neurotoksiinigeenien ilmentymistä suoraan. GTP lisäsi CodY:n vuorovaikutuksen voimakkuutta neurotoksiinigeenin promootterialueen kanssa, mikä viittaa siihen, että CodY-välitteinen neurotoksiinintuoton säätely on riippuvaista bakteerin ravitsemuksellisesta tilasta. C. botulinumin kylmänsietoa säätelevän kaksoiskomponenttijärjestelmän CBO0366/CBO0365:n osoitettiin ohjaavan noin 150 geenin ilmentymistä. Tähän joukkoon kuuluvien asetoni-butanoli-etanoli-käymiseen, arseeninsietoon sekä fosfaatin kuljetukseen liittyviä mekanismeja koodaavien geenien hiljentäminen heikensi merkittävästi kasvua 17 °C:ssa mutta vaikutti kasvuun 37 °C:ssa. Löydökset osoittavat näiden CBO0366/CBO0365 kaksoiskomponenttijärjestelmän säätelemien mekanismien olevan merkittäviä C. botulinumin kylmänsiedossa.
URI: URN:ISBN:978-951-51-0395-6
http://hdl.handle.net/10138/138817
Päiväys: 2014-11-28
Avainsanat: food hygiene
Tekijänoikeustiedot: Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.


Tiedostot

Latausmäärä yhteensä: Ladataan...

Tiedosto(t) Koko Formaatti Näytä
characte.pdf 1.293MB PDF Avaa tiedosto

Viite kuuluu kokoelmiin:

Näytä kaikki kuvailutiedot