Protein aggregation (literature review) : Soluble expression of human Ciliary neurotrophic factor in Escherichia coli (experimental work)

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151277
Title: Protein aggregation (literature review) : Soluble expression of human Ciliary neurotrophic factor in Escherichia coli (experimental work)
Author: Itkonen, Jaakko
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Pharmacy
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2014
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151277
http://hdl.handle.net/10138/144179
Thesis level: master's thesis
Discipline: Biofarmaci
Biopharmacy
Biofarmasia
Abstract: Proteins are endogenous molecules that carry out most biological functions in vivo. They are called as the biological workhorses. Proteins are made up of polypeptide chains that usually fold in the three dimensional space to adopt a native stable conformation. Stability of proteins is dependent on the interplay of environmental factors (pH, temperature, ionic strength). For most proteins, the biological function closely relates to the structural attributes of the protein. Misfolding or unfolding of proteins often result in aggregation. Protein aggregation in vivo is known to cause debilitating and fatal diseases such as Alzheimer's, Huntington's, Parkinson's and age related macular degeneration (AMD). Instability (physical and chemical) of proteins in vitro is believed to result in aggregation. This is a huge concern for the biopharmaceutical industry as it not only limits the effectiveness of the manufacturing process but also poses a great risk of fatality in vivo due to the immunogenic nature of the aggregates. Mechanisms of protein aggregation are complex and not well understood. Regulatory requirements for patient safety in biopharmaceutical products require characterization and analysis of aggregates in protein drug formulations. This review provides an overview of protein aggregation in general and highlights the different analytical methods used to characterize protein aggregates in biopharmaceuticals. Neurotrophic factors influence survival, differentiation, proliferation and death of neuronal cells within the central nervous system. Human ciliary neurotrophic factor (hCNTF) has neuroprotective properties and is also known to influence energy balance. Consequently, hCNTF has potential therapeutic applications in neurodegenerative, obesity and diabetes related disorders. Clinical and biological applications of CNTF necessitate a recombinant expression system to produce large amounts of functional protein. Previous studies have reported that recombinant expression of CNTF in Escherichia coli (E. coli) was limited by low yields and the need to refold the protein from inclusion bodies. In this report, we describe a strategy to effectively screen fusion constructs and expression conditions for soluble hCNTF production in E. coli. Most conditions tested with the codon optimized hCNTF sequence in fusion with soluble tags resulted in soluble expression of the protein. The construct 6-His-CNTF showed soluble expression in all the conditions tested. Our results suggest that codon optimization of the hCNTF sequence is sufficient for soluble expression in E. coli. The recombinant hCNTF was found to bind to CNTFRα with an EC50 = 36 nM.Proteiinit ovat endogeenisiä molekyylejä, jotka suorittavat lähes kaikki solun toiminnot ja ovat solun normaalille toiminnalle välttämättömiä. Proteiinit muodostuvat polypeptidiketjuista, jotka laskostuessaan normaalisti muodostavat stabiilin ja toimintakykyisen kolmiulotteisen rakenteen. Proteiinien stabiilius on riippuvainen ympäristön tekijöistä (pH, lämpötila, ionivahvuus, jne.) ja niiden keskinäisistä vuorovaikutuksista. Useimmilla proteiineilla niiden biologinen toiminta on läheisesti kytköksissä niiden rakenteeseen. Proteiinien vääränlainen laskostuminen tai laskoksen aukeaminen johtaa usein proteiinien ryvästymiseen eli aggregaatioon. In vivo proteiinien aggregaation tiedetään olevan osallisena aiheuttajana vaikeissa ja tappavissa sairauksissa, kuten Alzheimerin ja Parkinsonin taudissa, sekä verkkokalvon ikärappeumassa. In vitro, proteiinien fysikaalisen ja kemiallisen epästabiiliuden uskotaan johtavan aggregaatioon. Tämä on suuri huolenaihe varsinkin biofarmaseuttiselle teollisuudelle, sillä se rajoittaa proteiinilääkkeiden valmistuprosessin tehokkuutta. Tärkeämpänä syynä on kuitenkin proteiiniaggregaattien vahva immunogeeninen luonne, joka voi aiheuttaa vakavia seurauksia potilaissa. Proteiinien aggregaation mekanismit ovat monimutkaisia ja huonosti ymmärrettyjä. Biologisten lääkkeiden potilasturvallisuutta koskevat säännökset vaativat proteiinilääkeformulaatioilta proteiiniaggregaattien analyysiä ja karakterisointia. Tämä katsaus antaa yleiskuvan proteiiniaggregaatiosta ja keskittyy biologisten lääkkeiden proteaggregaattien analyysissa ja karakterisoinnissa käytettyihin metelmiin. Neurotrofiset tekijät vaikuttavat keskushermoston neuronien eloonjäämiseen, erilaistumiseen, leviämiseen ja säädeltyyn kuolemaan. Ihmisen siliaarisella hermokasvutekijällä (human Ciliary neurotrophic factor, hCNTF) on neuroneja suojaava ominaisuus ja sen tunnetaan vaikuttavan myös energiatasapainoon. Tästä syystä CNTF:llä onkin potentiaalista terapeuttista käyttöä neurodegeneratiivisten tautien ja aineenvaihduntatautien hoidossa. Tälläisia tauteja ovat esimerkiksi liikalihavuus ja diabetes. CNTF:n kliininen ja biologinen käyttö vaatii rekombinanttien ilmennysmenetelmien käyttöä, jotta voidaan tuottaa suuria määriä toiminnallista proteiinia. Aikaisemmissa tutkimuksissa on raportoitu rekombinantin CNTF:n Eschrecchia coli (E. coli) -soluissa tapahtuva ilmentäminen on rajoittunut alhaisen saannon vuoksi ja vaatii usein proteiinin uudelleenlaskostusta inkluusiojyväsistä. Tässä raportissa kuvaamme menetelmän, jolla voi seuloa tehokkaasti eri konstrukteja ja ilmentämisolosuhteita liukoisen hCNTF:n tuottamiseen E. coli-soluissa. Liukoisen proteiinien ilmentymistä havaittiin useimmilla liukoisen fuusioproteiinin ja kodonioptimoidulla hCNTF-sekvenssin yhdistelmillä ja tutkituissa ilmentämisolosuhteissa. Fuusiokonstruktin 6-His-CNTF havaittiin ilmentyvän liukoisena kaikissa tutkituissa olosuhteissa. Havaintomme viittaavat hCNTF:n sekvenssin kodonioptimoinnin olevan riittävä aikaansaamaan hCNTF:n ilmentyminen liukoisena E. coli-soluissa. Rekombinantin hCNTF:n havaittiin sitoutuvan CNTFRα:aan EC50-arvolla 36 nM.
Subject: hCNTF
E. Coli
biopharmaceuticals
excipients
stability
formulation
codon optimization
factorial screening
soluble expression
biologiset lääkkeet
apuaineet
stabiilisuus
formulaatio
kodonioptimointi
tekijöihin perustuva seulonta
liukoinen ilmennys


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Master's Thesis_Jaakko Itkonen.pdf 2.529Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record