Microchip technology in mass spectrometry-based bioanalysis: Advances in the analysis of peptides, proteins, and pharmaceuticals

Show full item record

Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-0860-9
Title: Microchip technology in mass spectrometry-based bioanalysis: Advances in the analysis of peptides, proteins, and pharmaceuticals
Author: Nordman, Nina
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Pharmacy
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Analytical microsystems are attractive in modern bioanalysis where sample amounts often are low and fast analyses are required. Microsystems also provide the prospect of integrating several functional elements on a single platform. The aim of this work was to develop analytical microsystems for fast analysis of bio- and drug molecules. For this, microchips with separation- and injection channels and monolithically integrated electrospray ionization (ESI) emitter were fabricated of epoxy photoresist SU-8 by photolithography and adhesive bonding. For peptide mass fingerprinting and protein sequencing characteristic tryptic peptides were fast and easily separated and detected by microchip capillary electrophoresis (MCE)-ESI/mass spectrometry (MS). Additionally, protein identification based on tandem MS fragmentation data of a single tryptic peptide was achieved. Finally, this rapid (total analysis time below ten minutes) microchip method permitted analysis of human muscle cell lysates. For online coupling of microchip capillary isoelectric focusing (cIEF) to ESI/MS a bilateral sheath flow interface or a two-dimensional separation unit was integrated on-chip. Rapid focusing of peptides by their isoelectric points (pI) was achieved without pretreatment of the SU-8 surface. After focusing the peptides were electrokinetically mobilized toward ESI/MS. The two-dimensional chip design enabled unique separation selectivity for peptides based on both pI values and intrinsic electrophoretic mobilities by multiplex-cIEF-transient-isotachophoresis. Rapid metabolic profiling was demonstrated from urine after intake of tramadol or paracetamol. Both phase I- and II metabolites were separated and detected by MCE-ESI/MS within 35 s. In addition, Michaelis-Menten kinetics was successfully determined for the CYP450-mediated oxidation of bufuralol to 1-hydroxybufuralol. Sample preconcentration (pretreatment) was integrated on-chip by solid-phase extraction (SPE) and liquid-phase microextraction (LPME). For SPE, a monolith zone was firmly anchored at the injection cross of the MCE-ESI/MS microchip by laser induced photopolymerization. The monolith was selective toward hydrophobic and hydrophilic sample molecules and enrichment factors as high as 23-fold was achieved with a loading time as short as 25 s. In addition, LPME was easily downscaled to low volume applications and offered selectivity in the analysis of phase I metabolites compared to SPE. In contrast to previous research in the same field this work offers bioanalysis with several on-chip integrated steps (preconcentration, injection, separation, and analysis) without considerably increasing the short analysis times characteristic of microchip assays.Inom bioanalytiken krävs ofta snabba och effektiva analytiska metoder samtidigt som tillgången till prov ofta är mycket liten. Här kan moderna mikroteknologiska metoder erbjuda effektiva lösningar genom att flera olika analytiska funktioner integreras på en cm2 stor plattform gjord av t.ex. glas, kisel eller polymerer. En sådan analytisk plattform kan enkelt transporteras till den plats där provet tas och producera snabba resultat som genast skickas till rätt ställe med hjälp av modern telekommunikation. Målet med detta arbete var att utveckla snabba mikroteknologiska metoder för att separera och analysera biomolekyler (t.ex. proteiner och peptider) och läkemedel. För detta ändamål tillverkades mikrochip av SU-8 polymer. Mikrochipen innehöll smala (µm) kanaler för att injicera och separera ämnen elektrokemiskt samt en integrerad skarp spets för elektrospray jonisering (ESI) följt av masspektrometrisk (MS) upptäckt. En orsak till sjukdomar är gener som inte producerar det protein (eller för lite/mycket av det) som kroppen behöver, eller producerar felaktigt protein. För att analysera proteiner klipps dessa enzymatiskt ned till peptider varefter peptiderna separeras och analyseras. De standardiserade metoderna här är ofta väldigt tidskrävande. I det här arbetet separerades peptider elektrokinetiskt på mikrochipet och analyserades på en tid kortare än 10 min per prov med hjälp av ESI/MS. När ett främmande ämne kommer in i kroppen reagerar denna med att snabbast möjligt eliminera ämnet. Detta sker oftast genom att levern omvandlar det främmande ämnet till ett ämne som lätt utsöndras med urinen. Dessa s.k. metaboliter kan ibland vara mer aktiva eller toxiska än modersubstansen, och det är av yttersta vikt att reda ut metabolismmönstret för nya läkemedel. Snabb metabolisk profilering gjordes här med hjälp av mikrochip-baserad elektrokinetisk separering följt av ESI/MS. Metaboliter utsöndrade i urin av tramadol och paracetamol kunde separeras från varandra och upptäckas på 35 sekunder med hjälp av mikrochip-baserad teknik. Trots att mikrochip-baserad elektrokinetisk separering redan är en relativt etablerad teknik där de största fördelarna är snabba analyser av väldigt små mängder prov och minimal konsumtion av lösningsmedel, finns fortfarande problem. Ett stort problem är att mängden injicerat prov är så liten att det krävs relativt höga koncentrationer för att klara detektorns begränsningar. I det här arbetet konstruerades även metoder för koncentration av läkemedelsmolekyler och deras metaboliter som en integrerad del av mikrochipet. Till skillnad från tidigare forskning på samma område erbjuds här bioanalyser där flera steg (koncentration, injicering, separation och analys) integreras på ett mikrochip utan att märkbart förlänga den korta analystiden som är typisk för mikrochipanalyser.
URI: URN:ISBN:978-951-51-0860-9
http://hdl.handle.net/10138/153635
Date: 2015-04-17
Subject: farmaceutisk kemi
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
microchi.pdf 5.008Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record