Alkaloids of in vitro cultures of Rhazya stricta

Show full item record

Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-38-8299-0
Title: Alkaloids of in vitro cultures of Rhazya stricta
Author: Akhgari, Amir
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Pharmacy, Division of Pharmaceutical Biosciences, Faculty of Pharmacy
VTT Technical Research Centre of Finland Ltd.
Thesis level: Doctoral dissertation (monograph)
Belongs to series: VTT Science, Dissertation 93 - URN:ISSN:2242-119X
Abstract: Rhazya stricta Decne. (Apocynaceae) is a traditional medicinal plant in the Middle East and South Asia. It produces a large number of terpenoid indole alkaloids(TIAs), some of which possess important pharmacological properties. This study focused on the establishment of biotechnological production tools of R. stricta, namely undifferentiated cell cultures, and an Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method to obtain hairy roots expressing heterologous genes from the early TIA pathway. As Rhazya alkaloids comprise a wide range of structures and polarities it was necessary first to develop different analytical methods to determine the alkaloid contents and changes in their profiles in transgenic cultures and after various treatments. Targeted and non-targeted analyses from cell andorgan cultures were carried out using gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS), high performance liquid chromatography (HPLC), ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Callus cultures were successfully initiated from five different explants onmodified B5 medium containing phytohormones. The phenotypes of the calli varied, but as was expected the callus cultures accumulated lower levels of alkaloids than wild type hairy roots and adventitious roots. Surprisingly, calli derived from stems had elevated levels of strictosidine lactam compared to other cultures. Transformation experiments revealed that only leaves but not cotyledons, hypocotyls or stem segments were susceptible to Agrobacterium infection and subsequent root induction. The transformation efficiency varied from 22% to 83% depending on the gene. Wild type and gus hairy root clones contained twofold higher amounts of alkaloids than adventitious roots. A total of 17 TIAs, including glycosylated alkaloids, were identified from hairy root extracts by UPLC-MS. GC-MS analysis allowed the separation of the most volatile and non-polar alkaloids in a single run. The composition of typical non-polar alkaloids indicated the occurrence of 20 TIAs belonging to nine different groups. The quantities of these alkaloids varied between clones in the order eburenine, vincanine, vallesiachotamine and yohimbine isomer II. The occurrence of pleiocarpamine, fluorocarpamine, vincamine, ajmalicine, and yohimbine isomers, analysed by GC-MS, and serpentine and its isomer, tetrahydrosecodinol as well as tabersonine, analysed by UPLC-MS, is reported here for the first time from R. stricta. Methyl jasmonate, a well-known elicitor, caused a significant increase in the total alkaloid content of wild type hairy roots as determined by NMR analyses. Detailed targeted analyses by GC-MS showed that the contents of eight out of ten studied alkaloids increased compared to non-elicited cultures. Another studied elicitor, chitosan, did not have any effect on individual alkaloid contents. Transgenic hairy root clones did not exhibit phenotype differences. Multivariate analysis from NMR data showed a clear discrimination between transformed and wild type/gus cultures. This was most probably due to differences in primary metabolites, as the total alkaloid content did not vary between different hairy roots and controls. In general, the production of individual TIAs, analysed by HPLC, was repressed in hairy roots transformed with geraniol synthase(ges) and geraniol 8-oxidase (g8o) genes compared to the wild types. Overexpression of the strictosidine synthase (str) gene resulted in a higher accumulation of serpentine, whereas the production of strictosidine lactam was decreased. There were no significant differences in the contents of other alkaloids compared to the wild type hairy roots. In conclusion, a simple and efficient gene transfer method is reported for R. stricta for the first time. New analytical methods were established which enabled comprehensive investigation of the alkaloids. These data might serve as a basis for further utilization of biotechnological methods for R. stricta and its further metabolic engineering.Rhazya stricta Decne. (Apocynaceae) on Lähi-idästä ja Kaakkois-Aasiasta kotoisin oleva perinteinen lääkekasvi. Se tuottaa lukuisia terpeeni-indolialkaloideja (TIA), joista useilla on tärkeitä farmakologisia ominaisuuksia. Tämä tutkimus keskittyi bioteknologisten menetelmien kehittämiseen R. stricta -kasville. Näihin menetelmiin lukeutuivat erilaistumattomien solukkoviljelmien perustaminen sekä Agrobacterium rhizogenes -bakteerin avulla aikaansaadut siirtogeeniset karva-juuret, jotka ilmensivät varhaisen TIA-synteesireitin geenejä. Rhazya-alkaloidit muodostavat laajan kirjon kemiallisia, erilaisen polaarisuuden omaavia rakenteita. Tästä syystä oli tärkeää kehittää uusia analyysimenetelmiä alkaloidi-pitoisuuksien määrittämiseen ja alkaloidiprofiilien muutosten seuraamiseen eri siirtogeenisten linjojen ja käsittelyiden välillä. Kohdennetut ja kohdentamattomat analyysit solu- ja solukkoviljelmistä suoritettiin kaasukromatografia-massaspektrometrialla (GM-MS), korkean erotuskyvyn neste-kromatografialla (HPLC), erittäin korkean suorituskyvyn nestekroma-tografialla (UPLC-MS) ja ydinmagneettisella resonanssispektroskopialla (NMR). Kallusviljelmät perustettiin viidestä eri kasvinosasta modifioidulle, kasvutekijöitä sisältävälle B5-kasvatusalustalle. Kallusten fenotyypit vaihtelivat, mutta kuten oletettua, ne tuottivat pienempiä määriä alkaloideja kuin villityypin juuret tai karvajuuret. Yllättäen varren soluista perustetut kallusviljelmät tuottivat suurempia määriä striktosidiinilaktaamia kuin muut soluviljelmät. Vain lehdet, toisin kuin sirkkalehdet, alkeisvarret tai varren osat, olivat alttiita agrobakteeri-infektiolle ja siten karvajuurten muodostumiselle. Transformaatio-tehokkuus vaihteli 22 ja 83 %:n välillä riippuen kohdegeenistä. Villityypin sekä gus-geeniä ilmentävät karvajuurilinjat tuottivat kaksinkertaisia määriä alkaloideja verrattuna tavallisiin juuriin. UPLC-MS -menetelmällä karvajuurista tunnistettiin kaikkiaan 17 terpeeni-indolialkaloidia, mukaan lukien glykosyloidut alkaloidit. GC-MS -analyysi mahdollisti myös kaikkein helpoimmin haihtuvien, poolittomien alkaloidien erottelun samalla kertaa. Tyypillisten poolittomien alkaloidien koostumus viittasi 20 TIA:n esiintymiseen, jotka voitiin edelleen jakaa yhdeksään ryhmään. Suurimmat vaihtelut alkaloidien pitoisuuksissa eri solulinjojen välillä havaittiin ebureniinin, vinkaniinin, vallesiakotamiinin ja johimbiinin isomeeri II:n kohdalla, tässä järjestyksessä. GC-MS:lla analysoitua pleiokarpamiinia, fluorokarpamiinia, vinkamiinia, ajmalisiinia ja johimbiini-isomeereja sekä UPLC-MS:lla analysoitua serpentiiniä ja sen isomeereja, tetrahydrosekodinolia ja tabersoniinia ei ole tätä ennen ole raportoitu R. stricta -kasvista. NMR-analyysi osoitti metyylijasmonaatin, joka on yleinen elisiittori, lisäävän merkittävästi alkaloidien kokonaismäärää villityypin karvajuurissa. Kohdennettu GC-MS -analyysi osoitti, että kahdeksan alkaloidin pitoisuus kymmenestä lisääntyi verrattuna käsittelemättömiin karvajuuriin. Toisaalta kitosaanilla, toisella elisiittorilla, ei havaittu olevan vaikutusta yhdenkään yksittäisen alkaloidin pitoisuuteen. Siirtogeeniset karvajuuret eivät poikenneet fenotyypiltään villityypin karvajuurista. NMR-datan monivarianssianalyysi osoitti kuitenkin selkeän eron siirtogeenisten ja villityypin tai gus-karvajuurien välillä. Tämä johtui todennäköisimmin eroista primäärimetaboliittien pitoisuuksissa, koska alkaloidien kokonaispitoisuudessa ei ollut eroa eri karvajuurilinjojen ja kontrollien välillä. Yksittäisten HPLC:lla analysoitujen terpeeni-indolialkaloidien tuotto oli yleisesti vähentynyt geraniolisyntaasi- (ges) sekä geranioli-8-oksidaasi-geenejä (g8o) ilmentävissä karvajuurilinjoissa verrattuna villityypin karvajuuriin. Striktosidiinisyntaasi-geenin (str) yli-ilmeneminen johti kohonneeseen serpentiini pitoisuuteen ja pienentyneeseen striktosidiinilaktaamin tuottoon. Muiden alkaloidien kohdalla ei havaittu merkittävää eroa villityypin karvajuuriin. Tässä työssä esitetään ensimmäistä kertaa yksinkertainen ja tehokas geenin-siirtomenetelmä R. stricta -kasville. Lisäksi kehitettiin joukko uusia analyysi-menetelmiä alkaloidien kokonaisvaltaiseen analysoimiseen. Nämä tulokset luovat pohjan bioteknologisten menetelmien laajemmalle käytölle R. stricta -kasvin kohdalla ja sen metabolian muokkaamiselle.
URI: URN:ISBN:978-951-38-8299-0
http://hdl.handle.net/10138/154446
Date: 2015-05-29
Subject: phamaceutical Biology
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
alkaloi.pdf 9.337Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record