The nuclear import mechanism of SRF co-activator MKL1

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-1494-5
Title: The nuclear import mechanism of SRF co-activator MKL1
Author: Rajakylä, Kaisa
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Department of Biosciences, perinnöllisyystiede
Biotekniikan Instituutti
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2015-09-25
Language: en
Belongs to series: URN:ISSN:2342-317X
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-1494-5
http://hdl.handle.net/10138/156394
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: An essential transcription factor Serum response factor (SRF) and its co-activators, Myocardin related transcription factors (MRTFs) regulate the expression of many target genes required for normal growth and actin cytoskeleton regulation. MKL1 (also known as MRTF-A and MAL) is one family member of MRTFs and mediates the signals from the cytoplasm to the nuclear SRF in response to changes in actin dynamics. Although it is well established that actin regulates nucleo-cytoplasmic shuttling of MKL1, the molecular mechanism of this regulation has not been characterized. Therefore the aim of this thesis was to reveal the mechanisms of MKL1 nuclear import. RNA interference (RNAi) screen identified two proteins as putative proteins mediating MKL1 nuclear localization: Importin-β (Ipoβ), which is the main import receptor in cells, and mRNA export factor Ddx19. The main purpose of this study was to confirm the hits from the RNAi screen and assess their specificity in regulating MKL1 localization. This work revealed that both Ipoβ and Ddx19 are specific and necessary factors for MKL1 nuclear import and thus required for SRF activation. We show that Ipoβ together with its adaptor protein Importin-α (Ipoα), binds to a bipartite nuclear localization signal (NLS) of MKL1, which is located in the actin-binding RPEL repeat and composed of two basic elements. Furthermore, the biochemical assays demonstrate that actin competes with Ipoα/Ipoβ heterodimer for access to the MKL1 NLS, thus explaining the inhibitory effect that actin binding has on MKL1 nuclear localization. By using advanced microscopy techniques, we show that Ddx19 adds an additional regulatory step for MKL1 nuclear import by modulating the conformation of MKL1, which affects its interaction with Ipoβ for efficient nuclear import. The ATPase cycle of Ddx19, which is crucial for its role in mRNA export, is not required in MKL1 nuclear import. In contrast, the RNA-binding activity of Ddx19 seems to be required. My work thus proposes a novel role for Ddx19, a well-known mRNA export factor and regulator of translation, in nuclear import of MKL1. In addition to MKL1, the conserved actin-binding RPEL repeat is also present in the Phosphatase and actin-regulating proteins (Phactrs). Our work demonstrates that the RPEL repeat of Phactr4 does not determine its localization in cells, but instead facilitates the competitive binding of monomeric actin and Protein phosphatase 1 (PPI) to Phactr4. This mechanism is required to control the phosphorylation status of cofilin, one of the downstream targets of PPI. Upon decrease in the cellular G-actin levels, Phactr4 activates cofilin through its binding to PPI, which leads to increase in the cellular levels of monomeric actin. Therefore our data pointed to an important role for Phactr4 in a feedback system, where actin monomers can locally regulate their own abundance. Thus this work highlights the role of RPEL repeat as a universal actin-binding site, which regulates actin homeostasis in cells.Seerumi responsiivinen faktori (SRF) on välttämätön transkriptiotekijä, joka yhdessä ko-aktivaattoreidensa kanssa säätelee monia solun normaaliin kasvuun sekä aktiinitukirangan säätelyyn tarvittavien proteiinien ilmentymistä. MKL1 (tunnetaan myös nimellä MRTF-A tai MAL) on monomeerista aktiinia (G-aktiini) sitova SRF:n koaktivaattori. Vasteena aktiinin polymerisaatiolle MKL1 kulkeutuu solun sytoplasmasta tumaan, jossa se yhdessä SRF:n kanssa aktivoi kohdegeenien transkriptiota. Aktiini on tärkeässä roolissa MKL1:n lokalisaation ja aktiivisuuden säätelijänä. MKL1 on suhteellisen suuri proteiini, joten sen kulkeutuminen tumaan täytyy tapahtua aktiivisesti. Vielä ei kuitenkaan tiedetä, miten ja mitkä proteiinin huolehtivat MKL1:n kuljetuksesta tumaan. Tämän asian selvittämiseksi seulottiin 80 tumakuljetukseen osallistuvaa proteiinia RNA-interferenssi (RNAi) menetelmää hyödyntäen. Seulonnan tuloksena löydettiin kaksi mahdollista MKL1:n lokalisaation säätelyyn osallistuvaa proteiinia: Importiini-β (Ipo-β), joka on hyvin yleinen kuljetusproteiini soluissa, sekä RNA-helikaasi Ddx19, joka osallistuu lähetti-RNA:n kuljetukseen ulos tumasta. Tämän työn pääasiallisena tarkoituksena oli varmistaa näiden proteiinien osallisuus MKL1:n lokalisaation säätelyssä. Tuloksemme osoittavat, että molemmat proteiinit, Ipo-β ja Ddx19, ovat tarpeellisia ja spesifisiä proteiineja MKL1:n kuljetuksessa tumaan ja näin ollen myös tärkeitä SRF:n aktiivisuuden säätelijöitä. Ipo-β yhdessä adaptoriproteiininsa Importiini-α:n (Ipo-α) kanssa tunnistaa MKL1:n N-terminaalisessa RPEL toistojaksossa sijaitsevan kaksiosaisen tumalokalisaatiosignaalin ja sitoutuu tähän. RPEL toistojakso voi sitoa myös aktiinia ja biokemialliset kokeemme osoittavatkin, että aktiini kilpailee Ipo-α/Ipo-β-heterodimeerin kanssa sitoutumisesta MKL1:n RPEL toistojaksoon. Hyödyntämällä edistyneitä mikroskooppitekniikoita, osoitamme, että Ddx19 osallistuu MKL1:n tumakuljetukseen muuntamalla MKL1:n konformaatiota, joka vaikuttaa MKL1:n ja Ipo-β:n väliseen interaktioon ja näin ollen tumakuljetuksen tehokkuuteen. Näytämme myös että lähetti-RNA:n kuljetuksessa tarvittava Ddx19:n ATPaasi aktiivisuus ei ole tarpeellinen MKL1:n tumakuljetuksessa. Sen sijaan Ddx19:n ominaisuus sitoa RNA:ta näyttäisi olevan tärkeää. Työni on siis tunnistanut aivan uuden roolin aiemmin lähetti-RNA:n kuljetukseen ja translaation säätelyyn liitetylle Ddx19:lle. MKL1:n lisäksi konservoitunut RPEL toistojakso esiintyy myös Phactr proteiini-perheen jäsenillä. Tuloksemme osoittavat, että toisin kuin MKL1:llä, RPEL toistojakso ei vaikuta Phactr4:n lokalisaatioon soluissa. Phactr4:n RPEL toistojakso voi sitoa sekä aktiinia että proteiini-fosfataasi I:tä (PPI) ja näiden proteiinien kilpaileva sitoutuminen Phactr4:n säätelee kofiliinin fosforylaatiota, joka on eräs PPI:n substraateista. Kun G-aktiinin konsentraatio soluissa on matala, Phactr4 aktivoi kofiliinin sitoutumalla PPI:n, mikä johtaa G-aktiinin konsentraation nousuun. Näin ollen tuloksemme osoittavat tärkeän roolin Phactr4:lle aktiinimonomeerien paikallisena säätelijänä. Tämä työ myös osoittaa että RPEL toistojakso sitoo yleisesti aktiinia ja säätelee aktiinifilamenttien ja monomeerien välistä tasapainoa soluissa.
Subject: solubiologia
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
nucleari.pdf 643.1Kb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record