IMAGING STUDIES IN THE MOUSE MODEL OF PROGRESSIVE MYOCLONUS EPILEPSY OF UNVERRICHT-LUNDBORG TYPE, EPM1

Show full item record

Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-1523-2
Title: IMAGING STUDIES IN THE MOUSE MODEL OF PROGRESSIVE MYOCLONUS EPILEPSY OF UNVERRICHT-LUNDBORG TYPE, EPM1
Author: Manninen, Otto
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Medicine, Institute of Biomedicine
Folkhälsan Institute of Genetics and Neuroscience Center and Research Programs Unit, Molecular Neurology, University of Helsinki, and Graduate School of Brain and Mind
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Belongs to series: Dissertationes Scholae Doctoralis Ad Sanitatem Investigandam Universitatis Helsinkiensis
Abstract: Unverricht-Lundborg type progressive myoclonus epilepsy (EPM1, OMIM 254800) is an autosomal recessive disorder characterized by onset at the age of 6 to 16 years, incapacitating stimulus-sensitive myoclonus and tonic-clonic epileptic seizures. It is caused by mutations in the gene encoding cystatin B (CSTB). However, the disease processes leading to the observed symptoms are currently unclear. Clinical magnetic resonance imaging (MRI) of the brain has shown neurodegenerative changes and computed tomography data have suggested a bone phenotype. This thesis examined the disease processes and the background of the pathological changes in the brain and the bone, utilizing modern imaging methods and image analysis methodology complemented with experimental data in the mouse model (the Cstb -/- mouse) of the disease. In order to gain a comprehensive picture of the disease progression in the brain, we performed a longitudinal imaging study in the Cstb -/- mouse. Animals were studied from the pre-symptomatic to fully symptomatic disease stages (1-6 mo). For studying atrophic changes, in vivo MRI volumetry was preformed once a month from 1 to 6 months of age. For investigating white matter (WM) changes, ex vivo diffusion tensor imaging (DTI) was performed at 2, 4 and 6 months. The fractional anisotropy (FA) maps derived from DTI data were analysed using track based spatial statistics (TBSS) that provided us with a hypothesis-free analysis of white matter changes. In vivo volumetry showed progressive volume loss in Cstb-/- mice over time, the rate of which was neither spatially nor temporally uniform over the brain. TBSS revealed progressing FA decrease, suggesting severe and widespread WM damage, with most drastic changes in the cerebellum and the thalamus. Subsequently the congruence of the observed WM changes between the mouse model and EPM1 patients were evaluated. In vivo DTI data from fully symptomatic adult patients and ex vivo data from fully symptomatic (6 mo) Cstb-/- mice were analysed using TBSS with matching protocols. The results revealed extensive changes with a pattern of chronic WM degeneration in EPM1 patients, with similar alterations detected in Cstb-/- mice. Furthermore, previously unknown brain regions were shown to be affected both in patients and in mice. The imaging data were then used to guide tissue level analyses in mice. The microstructural counterpart of the areas with decreased FA in mice was characterized by immunohistochemistry and transmission electron microscopy. Based on the tissue level findings, the extensive changes identified by DTI in both EPM1 patients and in Cstb-/- mice are probably a consequence of widespread WM loss upon axonal degeneration, and likely contribute to the motor disturbances present in the disease. Finally, we characterized the bone changes underlying the observed skeletal phenotype in EPM1 patients by performing microtomography (µCT), histology, and in vitro cell culture experiments with the Cstb-/- mouse. Analysis of bone microstructure in Cstb-/- mice using μCT revealed structural changes. Moreover, histology confirmed both structural and functional alterations. The basis of these findings was investigated by studying the functionality of bone resorbing osteoclasts differentiated in vitro from bone marrow. In resorption pit formation assays, less and smaller resorption pits were formed by Cstb-/- osteoclasts, indicating decreased resorptive capacity, likely due to a decrease in osteoclast numbers. These data imply that the skeletal changes in Cstb-/- mice and EPM1 patients are a result of CSTB deficiency leading to altered osteoclast function, and the results would indicate that CSTB has a more substantial role as a modulator of bone metabolism than previously thought. Our results showed high correlations of the atrophy, WM and bone phenotypes between EPM1 patients and Cstb-/- mice and provided information about brain and tissue level changes present in these pathologies. High correlation between the mouse model and the findings in patients provided further affirmation for the use of the mouse model in EPM1 research. Furthermore, the results provided new insight both into the progression of brain pathology and the processes underlying the bone changes present in the disease. Finally, our research introduced new methodologies for research in mouse models of neurodegenerative diseases, and raised the prospects of future research.Etenevä myoklonusepilepsia (Unverricht-Lundborgin tauti, EPM1) on suomalaiseen tautiperimään kuuluva, autosomaalisesti peittyvästi periytyvä sairaus, jonka ensimmäiset oireet havaitaan 6-15 vuoden iässä. Ensimmäiset oireet ovat useimmiten ulkoisten ärsykkeiden laukaisemia lihasnykäyksiä tai epileptisiä kohtauksia. EPM1 aiheutuu virheistä kystatiini B (CSTB) proteiinia koodaavassa geenissä ja vaikka taudin aiheuttava geenivirhe on selvitetty, oireisiin johtavat tautimekanismit ovat edelleen tuntemattomat. Kliininen magneettikuvantaminen on osoittanut potilaiden aivoissa harmaan aineen vauriota ja tilavuudenalenemaa ja tietokonekerroskuvauksessa potilailla on havaittu kallon luiden paksuuntumista. Tässä väitöskirjatyössä pyrittiin kartoittamaan EPM1:n etenemistä ja havaittujen muutosten aikaansaavia kudos- ja solutason muutoksia käyttäen moderneja kuvantamis- ja kuvankäsittelymenetelmiä sekä histologiaa ja soluviljelykokeita taudin kystatiini B puutteisessa (Cstb -/- hiiri) hiirimallissa. Taudin etenemistä aivoissa selvitettiin suorittamalla pitkittäisseurantaa taudin hiirimallissa. Kuvantaminen aloitettiin oireettomissa hiirissä, ja seurantaa jatkettiin kaikkien taudinkuvaan kuuluvien oireiden ilmenemiseen asti (1-6 kk). EPM1:ssä esiintyvän tilavuudenaleneman etenemistä tutkittiin in vivo magneettikuvantamisella, ja valkean aineen muutoksia ex vivo diffuusiotensorikuvamisella. Käyttäen hypoteesivapaata vokselipohjaista analyysimenetelmää (Track based spatial statistic, TBSS) valkean aineen muutoksia seurattiin analysoimalla fraktionaalisen anisotrofian (FA) muutoksia. Havaitsimme Cstb -/- hiirissä etenevän tilavuudenaleneman, jonka määrä vaihteli eri aivoalueiden välillä. Diffuusiotensorikuvantaminen osoitti etenevään aivokudoksen vaurioon viittaavan FA aleneman, joka ilmeni voimakkaimmin talamuksissa ja pikkuaivossa. Seuraavaksi kartoittamme havaittujen valkean aineen vaurioiden yhtenevyyttä hiirimallissa ja potilaissa. Aikuisten EPM1 potilaiden in vivo ja aikuisten Cstb -/-(6kk) hiirten ex vivo diffuusiotensorikuvantamisdata analysoitiin käyttäen identtisiä TBSS- protokollia. Tulokset osoittivat laaja-alaisia, krooniseen rappeumaan viittaavia valkean aineen muutoksia EPM1-potilaissa, ja hiirimallissa havaittiin vastaavat muutokset. Analyysi paljasti sekä potilaissa, että Cstb -/- hiirissä muutoksia aivoalueilla, joiden ei ole aikaisemmin tiedetty EPM1:ssä vaurioituneen. Havaittujen muutosten alkuperää tutkittiin Cstb -/- hiirissä kudostason tarkastelulla soluleikkeistä immunohistokemiallisin värjäyksin, ja elektronimikroskooppisella analyysillä. Tulokset osoittivat että sekä EPM1 potilaissa että hiirimallissa diffuusiokuvantamisella havaitut valkean aineen muutokset ovat seurausta aksonikadosta, ja ovat todennäköisesti yhteydessä taudissa esiintyviin liikehäiriöihin. EPM1-potilailla havaittujen luumuutosten taustoja selvitettiin Cstb -/- hiirissä tietokonekerrokuvauksella (microtomography; uCT), kudosleikevärjäyksillä ja soluviljelykokein. Tietokonekerroskuvaus osoitti luun hienorakenteen muuttuneen Cstb -/- hiirissä, minkä lisäksi kudosleikevärjäyksissä todettiin luussa sekä rakenteellisia että toiminnallisia muutoksia. Näiden muutosten alkuperää kartoitettiin luuta kierrättävien osteoklastien soluviljelykokein. Kun solujen kykyä hajottaa luuta tutkittiin, havaittiin Cstb -/- hiirten osteoklastien muodostavan vähemmän ja pienempiä resorptiivisia kuoppia. Tämä kertoo osteoklastien heikommasta hajotuskyvystä, ja muutos Cstb -/- hiirissä on todennäköisesti seurausta matalammasta solumäärästä viljelmissä. Vaikuttaa siltä, että sekä EPM1 potilaissa, että taudin hiirimallissa havaitut luumuutokset ovat seurasta kystatiini B puutteen aiheuttamista muutoksista osteoklastien toiminnassa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että kystatiini B:llä on aikaisempaa suurempi rooli luun metabolian säätelyssä. Tutkimustuloksemme hiirissä vastasivat potilaissa havaittua aivojen tilavuudenalenemaa, valkean aineen vaurioita ja luulöydöksiä, ja pystyimme osoittamaan niihin johtavat kudos- ja solutason muutokset. Havaintomme valottavat EPM1:n huonosti tunnettua etenevää taudinkuvaa, sekä ennestään tunnettujen muutosten taustaa, ja löydösten yhteneväisyys hiirimallissa ja potilaissa rohkaisee EPM1-tutkimuksen jatkamista Cstb -/- hiirimallissa. Väitöskirjatutkimus esitteli myös uusia menetelmiä aivorappeumatautien hiirimallitutkimuksessa sekä avasi uusia tutkimusalueita EPM1:n taudinkuvan selvittämisessä.
URI: URN:ISBN:978-951-51-1523-2
http://hdl.handle.net/10138/156439
Date: 2015-10-16
Subject: biolääketiede
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
imagings.pdf 5.881Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record