Diagnostics and epidemiology of Aleutian mink disease virus

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-1745-8
Title: Diagnostics and epidemiology of Aleutian mink disease virus
Author: Knuuttila, Anna
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Veterinary Medicine, Department of Veterinary Biosciences
University of Helsinki, Faculty of Medicine, Department of Virology
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2015-12-11
Belongs to series: Dissertationes Schola Doctoralis Scientiae Circumiectalis, Alimentariae, Biologicae, Universitatis Helsinkiensis - URN:ISSN:2342-5431
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-1745-8
http://hdl.handle.net/10138/158058
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Aleutian mink disease virus (AMDV) is a widespread parvovirus mainly affecting American mink (Neovison vison). It can cause a progressive and persistent immune complex-mediated disease (Aleutian disease, AD) in adult mink and an acute and fatal pneumonia in mink kits. The virus has a wide geographical distribution both in farmed mink and in the wild. Aleutian mink disease virus poses a major economic threat to mink farmers and it may affect the conservation and management of indigenous mustelids and other species. Infected farms are difficult to sanitize as the virus is resistant to physical and chemical treatments, it can be transmitted through several vectors and routes, and no effective medications or vaccines currently exist. Since the 1970s, diagnosis on AMDV in farmed mink has been based on the identification of specific antibodies with a counter-current immunoelectrophoresis (CIEP) test. In 2005, the Finnish Fur Breeders Association implemented an eradication program that required the development of a new AMDV-detection protocol to screen ca. 600 000 samples per year. Although AMDV can infect and may cause disease in other mustelids and carnivores, little is known about the epidemiology and evolutionary relationships of AMDV strains in the wild in Finland and elsewhere. Thus, this study aimed to develop a modern automated test for the large-scale serodiagnosis of AMDV in mink and to elucidate the epidemiology and phylogeny of this virus in farmed mink and free-ranging mustelids in Finland. A new antigen for the serological test was developed with a recombinant DNA technique. The major capsid protein (VP2) gene of a Finnish AMDV strain obtained from a farmed mink was amplified, cloned into a baculovirus transfer vector with subsequent recombination to baculovirus genome, and expressed in insect cells. The antigen formed virus-like particles and was confirmed to be antigenic with several serological methods. Subsequently, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was designed for the antigen and automated. Because the small glass capillaries used to collect blood samples in CIEP could not be utilized in the ELISA test, a wicking technique using a filter paper blood comb was developed. The performance of this test was compared to CIEP (an imperfect gold standard) by testing blood/serum samples from farmed mink. The results were analyzed with Bayesian modelling allowing for conditional dependence. The new automated ELISA test was found to be accurate with a diagnostic sensitivity of 96.2% (95% probability interval [PI], 91.5 99.0) and specificity of 98.4% (95% PI, 95.3 99.8), and was therefore determined suitable for the serodiagnosis of AMDV. The epidemiology and phylogenetics of AMDV were inferred from organ and/or blood samples from farmed mink and free-ranging mustelids. The samples were screened with the newly-developed ELISA (described above) or CIEP test for anti-AMDV antibodies and with previously described or newly-developed PCR assays for AMDV DNA. Test results were studied with statistical, phylogenetic, and sequence analysis methods. Aleutian mink disease virus was found to be prevalent in the wild in Finland. A new host species, the European badger (Meles meles), with a prevalence of 27% (7/26; 95% confidence interval [CI], 13 46), was identified. In addition to the badger, infection markers were found in 54% (31/57; 95% CI, 42 67) of feral American mink and in one European polecat (Mustela putorius) (1/14; 95% CI, 1 29). No infection was found in Eurasian otters (Lutra lutra) (24; 95% CI, 0 10), European pine martens (Martes martes) (183; 95% CI 0 1), least weasels (Mustela nivalis) (2; 95% CI, 0 67), stoat (Mustela erminea) (1; 95% CI, 0 85), or wolverine (Gulo gulo) (1; 95% CI, 0 85). Positive animals were distributed throughout western, southern, and eastern Finland (10/17 of sampled regions). American mink (odds ratio [OR], 335) and badger (OR, 74) had higher odds of infection compared to other species. Also, animals sampled during the first sampling period (2006 2009; OR, 5) had higher odds of infection compared to the second period (2010 2014). No significant association was detected between infection and age, sex, or region. Furthermore, mink farms were not associated with higher odds of AMDV infection nor appeared to serve as a major source of infection for free-ranging mustelids at the municipal or regional level. Based on these results, it appears that domestic and sylvatic transmission pathways are largely decoupled, but it seems probable that infections occasionally move between the farmed and wild populations (e.g., via infected escapees/intruders). A phylogenetic analysis, including Finnish, Estonian, and global strains, indicated that AMDV strains form at least five main clusters. It also inferred that the virus has been introduced to Finnish farms on at least three occasions. Unfortunately, it could not be discerned whether the occurrence of AMDV in Finland is natural or a consequence of the global mink trade. In addition to its main hosts (farmed and wild mink), similar strains of AMDV were found in pine martens, polecats, and badgers. Interestingly, Estonian badgers carried a divergent strain, possibly representing a new amdoparvovirus. Other than the strain found in Estonian badgers, and the tendency of strains from Finnish farmed and feral mink to diverge into separate clusters, AMDV strains did not cluster according to location, year, species, or pathogenicity. The nucleotide differences between Finnish AMDV sequences, based on partial non-structural protein 1 gene, ranged from 0% to 14% and similar levels of variability were observed in farmed and natural populations. As a result of these studies, an automated ELISA test for the serodiagnosis of AMDV was developed and validated with high diagnostic sensitivity and specificity. The test offers a low cost, easy sampling, rapid throughput of large sample numbers, reduced processing time, and automated data management. The new test can be utilized for the monitoring, control and eradication of the virus, calculating the seroprevalence, and confirming the infection status of farms or individual mink. In addition, new information on AMDV epidemiology and genetic variation in Finnish farmed mink and free-ranging mustelids were established with potential impact on the biosecurity of farms, outbreak investigations, and the conservation of threatened mustelid species. Moreover, the new diagnostic tools and additional sequence data generated in this study can be utilized in the future research on the epidemiology of AMDV.Aleutian tautivirus (Aleutian mink disease virus, AMDV, plasmasytoosivirus) on yleinen minkeillä (Neovison vison) esiintyvä parvovirus. Aikuisilla eläimillä AMDV voi aiheuttaa kroonisen immuunivälitteisen sairauden (Aleutian tauti, Aleutian disease, AD, plasmasytoosi) ja pennuilla akuutin kuolemaan johtavan hengitystiesairauden. Viruksella on laaja maantieteellinen levinneisyys ja tarhattujen minkkien lisäksi sitä tavataan myös luonnossa. Tartunnan saaneita minkkitiloja on vaikea saneerata, sillä virus voi säilyttää taudinaiheutuskykynsä erilaisista puhdistus- ja desinfektiotoimenpiteistä huolimatta. Lisäksi AMD-virus leviää useiden eri reittien välityksellä, eikä sitä vastaan ole tehokasta hoitoa tai rokotetta. Aleutian tautivirus aiheuttaa tarhaajille merkittäviä taloudellisia tappioita ja sillä saattaa olla merkitystä myös kotoperäisten näätäeläinlajien suojelussa. Tarhattujen minkkien tautidiagnostiikka on 1970-luvulta lähtien perustunut AMDV-vasta-aineiden tunnistamiseen seeruminäytteestä vastavirtaimmunoelekroforeesitestillä (counter-current immunoelectrophoresis, CIEP, ns. agartesti). Suomen Turkiseläinten Kasvattajain Liitto käynnisti Aleutian taudin hävitysohjelman vuonna 2005. Tämän vuoksi CIEP-menetelmälle tarvittiin korvaava testi, joka voitaisiin automatisoida ja joka soveltuisi suurien näytemäärien (noin 500 000 700 000 vuodessa) käsittelyyn. Minkin lisäksi AMDV kykenee tarttumaan myös muihin näätä- ja petoeläinlajeihin. Suomalaisten viruskantojen epidemiologiasta ja evolutiivisista suhteista on vain vähän tietoa, ja etenkin luonnonvaraisten näätäeläinten tilanne on tuntematon sekä Suomessa että maailmanlaajuisesti. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää uusi serologinen testi AMDV-tartunnan toteamiseksi minkeissä sekä selvittää tämän viruksen epidemiologiaa ja evolutiivisia suhteita tarhatuissa minkeissä ja luonnonvaraisissa näätäeläimissä Suomessa. Tässä väitöskirjatyössä kehitettiin ja automatisoitiin uusi entsyymi-immunologiseen määritykseen (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) perustuva testi AMD-viruksen vasta-aineiden toteamiseksi tarhatuissa minkeissä. ELISA-testiä varten rakennettiin uusi antigeeni yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttäen. Suomalaisen AMD-viruskannan kuoriproteiinin (VP2) geeni kloonattiin bakulovirukseen, joka tuotti VP2-proteiinia hyönteissoluissa. Tämä proteiini muodosti tyhjiä viruksen kaltaisia partikkeleita, joiden todettiin olevan antigeenisia useilla serologisilla menetelmillä. Koska CIEP-menetelmässä verinäytteenottoon käytetyt lasikapillaarit eivät soveltuneet käytettäväksi ELISA-menetelmässä, tätä tarkoitusta varten kehitettiin uusi näytteenottomenetelmä, suodatinpaperista valmistettu näytteenottokampa. Uuden ELISA-menetelmän toimivuutta verrattiin CIEP-menetelmään (ns. epätäydellinen kultainen standardi) testaamalla veri- tai seeruminäytteitä minkeistä. Nämä tulokset analysoitiin Bayesian mallintamisella, jossa huomioitiin testien riippuvuus. Uuden ELISA-testin diagnostinen herkkyys oli 96.2 % ja tarkkuus 98.4 % ja sen todettiin soveltuvan AMDV:n serodiagnostiikkaan. Aleutian tautiviruksen epidemiologista ja fylogeneettistä tutkimusta varten kerättiin elin- ja/tai verinäytteitä tarhatuista minkeistä ja luonnonvaraisista näätäeläimistä. Näytteet tutkittiin vasta-aineiden varalta joko CIEP- tai uudella ELISA-menetelmällä. Viruksen DNA:ta todennettiin joko jo olemassa olevilla tai tätä tarkoitusta varten kehitetyillä uusilla PCR-testeillä. Tulokset analysoitiin useilla erilaisilla tilastollisilla, fylogeneettisillä ja sekvenssianalyysimenetelmillä. Tutkimuksissa todettiin, että AMDV-tartunta on yleinen Suomen luonnonvaraisissa näätäeläimissä. Aleutian tautivirusta löydettiin tiettävästi ensimmäistä kertaa mäyristä (Meles meles), joissa tartunta todettiin 27 %:ssa (7/26) tutkituista näytteistä. Mäyrän lisäksi positiivisia näytteitä todettiin 54 %:lla villiminkeistä (31/57) ja yhdellä hillerillä (14) (Mustela putorius). Saukoista (Lutra lutra) (24), näädistä (Martes martes) (183), lumikoista (Mustela nivalis) (2), kärpästä (Mustela erminea) (1) ja ahmasta (Gulo gulo) (1) kerätyt näytteet olivat negatiivisia. Tartunta oli levinnyt laajalle maantieteellisesti ja positiivisia eläimiä löytyi sekä Länsi-, Etelä- että Itä-Suomen maakunnista. Tartunnalle altistavia tekijöitä olivat eläimen laji ja näytteenottoajanjakso. Villiminkeillä oli 335-kertainen ja mäyrillä 74-kertainen suhteellinen tautipaine verrattuna muihin lajeihin ja vuosijaksona 2006 2009 suhteellinen tautipaine oli 5-kertainen verrattuna vuosiin 2010 2014. Ikä, sukupuoli ja maakunta eivät sen sijaan olleet riskitekijöitä tartunnalle. Minkkitilat eivät ilmeisesti ole, ainakaan suuressa mittakaavassa kunnan ja maakunnan tasolla, merkittävä tartunnan lähde luontoon. Vaikuttaakin siltä, että tarhattujen minkkien ja luonnonvaraisten näätäeläinten tartuntaketjut ovat pääasiassa erillisiä. Satunnaisia tartuntoja näiden välillä kuitenkin todennäköisesti tapahtuu. Suomalaisten, virolaisten ja globaalien viruskantojen fylogeneettisen analyysin perusteella AMDV-kannat jakautuvat viiteen eri geneettiseen ryhmään. Näyttää siltä, että suomalaisille tiloille virus on saapunut ainakin kolmeen eri otteeseen. Suomalaisten viruskantojen alkuperä jäi kuitenkin epäselväksi. On mahdollista, että virus on tullut Suomeen jalostuseläinten mukana muista minkinkasvattajamaista, mutta toisaalta suomalaiset kotoperäiset näätäeläimet ovat saattaneet kantaa virusta jo ennen minkkitarhauksen alkamista. Tarhatuille ja villiminkeille tyypillisiä kantoja todettiin myös näädissä, hillereissä ja mäyrissä, joten AMDV kykenee ylittämään lajirajat. Virolaisista mäyristä löytyi kuitenkin myös hyvin poikkeava kanta, joka edustaa mahdollisesti kokonaan uutta amdoparvoviruslajia. Lukuun ottamatta tätä virolaisissa mäyrissä todettua erilaista viruskantaa ja sitä, että suomalaisista tarhatuista ja villiminkeistä löytyneet kannat näyttävät muodostavan erillisiä ryhmittymiä, selkeää jakautumista eri genoryhmiin maantieteellisen sijainnin, näytteenottoajankohdan, isäntälajin tai patogeenisuuden perusteella ei havaittu. Osittaisen NS1-geenin (non-structural protein 1) perusteella suomalaisten AMDV-viruskantojen nukleiinihappojen erot vaihtelivat 0 %:sta 14 %:iin ja vaihtelevuus oli samankaltaista sekä tarhatuista minkeistä, että luonnonvaraisista näätäeläimistä eristetyillä viruskannoilla. Tässä väitöskirjatyössä kehitettiin uusi automatisoitu ELISA-menetelmään perustuva testi minkin Aleutian taudin diagnostiikkaa varten. Tällä testillä on useita etuja, kuten alhaiset kustannukset, helppo näytteenotto, nopea läpimenoaika isoille näyte-erille, vähentynyt käsityövaltaisuus sekä automaattinen tulosten luku, tallennus ja käsittely. Tätä testiä voidaan hyödyntää taudin kontrolloinnissa ja hävittämisessä, esiintyvyyden laskemisessa ja tilojen sekä yksittäisten eläinten tautivapauden todentamisessa. Lisäksi saatiin lisätietoa AMD-viruksen epidemiologiasta ja fylogeniasta suomalaisissa tarhaminkeissä sekä luonnonvaraisissa näätäeläimissä. Näillä tuloksilla voi olla vaikutusta tilojen tautitorjunnassa, taudinpurkausten selvittämisessä sekä uhanalaisten näätäeläinten suojelussa. Lisäksi tässä yhteydessä kehitettyjä uusia diagnostisia menetelmiä ja uusien viruskantojen sekvenssejä voidaan hyödyntää viruksen epidemiologiaan liittyvissä jatkotutkimuksissa.
Subject: eläinlääketieteellinen mikrobiologia ja epidemiologia
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
diagnost.pdf 1.047Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record