Binding of fecal bacteria to Caco-2 cell line as a pre-selection step in isolating commensals with potential to inhibit Clostridium difficile adhesion

Show full item record

Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201602161160
Title: Binding of fecal bacteria to Caco-2 cell line as a pre-selection step in isolating commensals with potential to inhibit Clostridium difficile adhesion
Author: Jouhten, Hanne
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Food and Environmental Sciences
Thesis level: master's thesis
Abstract: Clostridium difficile -infektio kehittyy tyypillisesti antibioottihoidon yhteydessä, kun suolistomikrobisto ei kykene ylläpitämään kolonisaatioresistenssiä mikrobiston koostumuksen häiriinnyttyä. Terve mikrobisto voidaan palauttaa ja C. difficile -bakteeri häätää ulosteensiirrolla, mikä on yksi harvoja toimivia hoitokeinoja vaikeissa uusiutuvissa infektioissa, joihin antibioottihoito ei tehoa. Ulosteensiirto on tutkitusti tehokas hoitokeino, mutta on vielä epäselvää mitkä ulosteen bakteerilajit ja mitkä niiden ominaisuudet ovat hoitotehon edellytys. Tämä tutkimus perustui hypoteesiin, jonka mukaan jotkut suoliston epiteelisoluihin kiinnittyvät normaalimikrobiston bakteerit voivat kilpailemalla estää C. difficile -bakteerin kiinnittymistä ja kolonisaatiota suolistoon. Noiden bakteereiden eristäminen ulosteesta mahdollistaisi tarkemmat mekanistiset tutkimukset ja C. difficile -infektion bakteeriterapiahoitoon sopivan tuotteen kehittämisen niistä. Ulostebakteerien kiinnittymistä Caco-2-solulinjaan käytettiin esi-selektiovaiheena epiteelisoluihin kiinnittyvien bakteerien eristämisessä luovutetusta ulosteesta. Mikrobiston koostumus ulosteessa ja siitä enterosyytteihin sitoutuneissa sekä viljellyissä bakteeripopulaatioissa määritettiin osittaisten 16S rDNA -juosteiden sekvensoimisella käyttäen MiSeq -menetelmää. Esi-selektio osoittautui toimivaksi lähestymistavaksi, sillä eristettyjen bakteeripopulaatioiden koostumus poikkesi alkuperäisestä sekä epiteeliin sitoutumisen että viljelyn jälkeen. Lisäksi eristetyistä populaatioista puhdistetut bakteerikannat kiinnittyivät hyvin enterosyytteihin. Myös ulostebakteerien kykyä kilpailla C. difficile -bakteerin kanssa kiinnittymisestä suoliston epiteelisoluihin in vitro tutkittiin. Caco-2-soluihin kiinnittyneistä populaatioista eristettyjä bakteereita kilpailutettiin C. difficile -bakteerin kanssa kilpailu- ja ekskluusiomenetelmiä käyttäen sekä monilajisina populaatioina että puhdistettuina kantoina. Osa bakteerikannoista ja -populaatioista vähensivät C. difficile -bakteerin sitoutumista epiteelisoluihin. Käytetyt menetelmät vaativat kuitenkin vielä kehittelyä ja tulosten varmistaminen enemmän toistoja. Saadut tulokset ovat kuitenkin lupaavia ja hyödyllinen perusta tulevalle työlle C. difficile -infektion bakteeriterapiahoidossa käytettävän tuotteen kehittämisessä.Clostridium difficile infection (CDI) is a microbiota-related disease. Typically, antibiotic-induced perturbation of gut microbiota precedes the infection, while a healthy gut microbiota provides protection, i.e. colonization resistance, against it. Furthermore, in the case of recurrent CDI that is not resolved by antibiotics, restoring the gut microbiota with a fecal microbiota transplantation (FMT) is among the few treatment options that really work. Although FMT is effective in the treatment of CDI, the factors behind treatment success remain unclear. Both, the key species and the functions that are necessary to restore the healthy microbiota and eradicate C. difficile, are a matter of speculation. This study was based on the hypothesis that the adherence of some commensal bacteria to the gut epithelial cells could play a role in eradicating C. difficile by competing for epithelial binding with it. Furthermore, the isolation of those bacteria from the donor feces would enable more detailed mechanistic studies and development of a bacterial product for the treatment of CDI in the future. As a pre-selection step, bacterial adhesion to Caco-2 cells was utilized to isolate and cultivate epithelium-adherent bacteria from the donor feces. Microbiota composition of fecal sample, and the adhered and cultured sub-populations thereof, was determined by partial 16S rDNA amplicon sequencing using MiSeq method. The pre-selection approach was successful, since the obtained populations were different, both after the adhesion and cultivation, as compared to the original fecal sample. In addition, most obtained pure isolates adhered well to enterocytes. The ability of fecal bacteria to compete with C. difficile for binding to gut epithelial cells in vitro was also studied. Isolated bacteria from Caco-2-adhered populations were applied in competition and exclusion assays with C. difficile as purified or multi-species cultures, and reduction in C. difficile binding was observed due to the certain bacteria or bacterial populations. These assays still need developing and the results must be confirmed with more repetitions. However, the results are promising and a useful ground for future work in developing bacteriotherapeutic formulations for the treatment of CDI.
URI: URN:NBN:fi:hulib-201602161160
http://hdl.handle.net/10138/160183
Date: 2015
Subject: Intestinal microbiota
Clostridium difficile infection
Fecal microbiota transplant
Bacteriotherapy
Bacterial adhesion
Caco-2 cell line
Discipline: Mikrobiologi
Microbiology
Mikrobiologia


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record