The Role of the Small Rab24 GTPase in Autolysosome Clearance

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201605031567
Title: The Role of the Small Rab24 GTPase in Autolysosome Clearance
Author: Honkanen, Riina
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Agricultural Sciences
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2016
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201605031567
http://hdl.handle.net/10138/161653
Thesis level: master's thesis
Discipline: Bioteknik (MAAT)
Biotechnology (MAAT)
Biotekniikka (MAAT)
Abstract: Autophagy is a major cellular catabolic pathway which is responsible for the degradation of protein aggregates and damaged organelles, as well as the replenishment of the cellular energy levels during starvation by degrading dispensable cytoplasmic components. In autophagy, cytoplasmic material is sequestered in double-membrane vesicles termed autophagosomes, which ultimately fuse with the endosomal and lysosomal compartment to form organelles called autolysosomes, in which the secluded cellular constituents are digested. The degradation products are transported back to the cytoplasm, and the cell can use them for biosynthetic reactions or energy production. Rab GTPases are key regulators of intracellular membrane trafficking, functioning in multiple processes including autophagy. They undergo a so-called Rab GTPase cycle, where they mediate downstream signalling according to the bound guanine nucleotide. Rab GTPases are generally small, 20-25 kDa of size, and are structurally conserved throughout phylogeny with the exception of the hypervariable C-termini. However, Rab24 GTPase contains unique amino acids that confer special characteristics not found among other Rab GTPases, such as low intrinsic GTPase activity. Rab24 GTPase has been implicated in the late stages of autophagy, where it has been suggested to function in autolysosomal clearance. The role of Rab24 GTPase in autophagy was further studied in this thesis using Rab24 siRNA and control siRNA transfected HeLa cells with stable expression of mRFP-GFP-LC3, labelled with a mixture of LAMP1 and LAMP2 antibodies. LAMP1 and LAMP2 are lysosomal membrane proteins. The tandem fluorescent-tagged mRFP-GFP-LC3 construct localises to autophagic vacuoles and fluoresces both mRFP and GFP under non-acidic conditions. However, the maturation of the autophagic vacuoles with the simultaneous decrease in the pH abolishes the GFP fluorescence, while mRFP is more acid resistant and continues to fluoresce. The formation of autolysosomes was followed by indirect immunofluorescence labelling with LAMP1/2 antibodies in HeLa mRFP-GFP-LC3 cells. The cells were imaged with a confocal microscope and colocalization of the three colours was analysed in three dimensions with Imaris software. The volumes of GFP and mRFP-positive vesicles (autophagosomes) as well as mRFP and LAMP1/2-positive vacuoles (autolysosomes) between control and Rab24 silenced cells were similar in full culture medium and up to 4 h of serum and amino acid starvation. However, the volume of autolysosomes as well as of the LAMP1/2-labelled compartments was substantially higher in Rab24 depleted cells compared to control cells after 6h of starvation. Taken together, these findings indicate that Rab24 is dispensable for autophagosome formation and maturation, and that Rab24 may be involved in autolysosomal clearance upon prolonged serum and amino acid starvation.Autofagia on soluille merkittävä katabolinen reitti, joka vastaa proteiiniaggregaattien ja vahingoittuneiden soluorganellien hajotuksesta sekä solujen energiatasojen säilyttämisestä niukkaravinteisissa olosuhteissa. Viimemainittu tapahtuu hajottamalla tarpeettomia soluliman komponentteja. Autofagiassa soluliman ainesosia eristetään kaksoiskalvollisiin autofagosomeiksi kutsuttuihin vesikkeleihin. Autofagosomit yhdistyvät lopulta endosomaalisen ja lysosomaalisen osaston kanssa muodostaen autolysosomin, jossa autofagosomien sisältö hajotetaan. Hajotustuotteet kuljetetaan takaisin solulimaan, ja solu voi käyttää ne rakennusaineina tai energiantuotannossa. Rab GTPaasit ovat tärkeitä solunsisäisiä kalvoliikenteen säätelijöitä, jotka toimivat useilla solun eri reiteillä, muun muassa autofagiassa. Rab GTPaasit läpikäyvät niin kutsutun Rab GTPaasi syklin, jossa niihin kiinnittynyt guaniininukleotidi määrittelee seuraavat solutapahtumat. Rab GTPaasit ovat yleensä pieniä, 20-25 kDa:n kokoisia, ja niiden rakenne on säilynyt hypervariaabelia C-terminusta lukuun ottamatta. Rab24 GTPaasilla on kuitenkin ainutlaatuisia aminohappoja, jotka antavat sille erityisiä ominaisuuksia, kuten alhainen luontainen GTPaasin aktiivisuus. Rab24 GTPaasin on esitetty olevan osallisena autofagian myöhäisvaiheessa, jossa sen on ehdotettu toimivan autolysosomien kierrätyksessä. Rab24 GTPaasin roolia autofagiassa tutkittiin tässä Pro gradussa käyttämällä Rab24 siRNA:lla ja kontrolli siRNA:lla transfektoituja HeLa soluja, jotka ilmentävät pysyvästi mRFP-GFP-LC3:a. Solut oli leimattu LAMP1 ja LAMP2 vasta-aineseoksella. LAMP1 ja LAMP2 ovat lysosomaalisia kalvoproteiineja. Kaksoisfluoresoiva mRFP-GFP-LC3 konstrukti paikantuu autofagisiin vakuoleihin ja fluoresoi sekä mRFP:tä että GFP:tä neutraaleissa olosuhteissa. Autofagisten vakuolien kypsyminen ja niiden samanaikainen pH:n aleneminen kuitenkin sammuttaa GFP:n fluoresenssin, kun taas mRFP on happamalle vastustuskykyisempi ja jatkaa fluoresointia. Autolysosomien muodostumista seurattiin epäsuoran LAMP1/2 –immunofluoresenssileimauksen avulla HeLa mRFP-GFP-LC3 soluissa. Solut kuvattiin konfokaalimikroskoopilla ja leimojen paikantumista analysoitiin kolmiulotteisesti Imaris-ohjelmalla. GFP ja mRFP-positiivisten vesikkelien (autofagosomien) sekä mRFP ja LAMP1/2-positiivisten vakuolien (autolysosomien) tilavuudet kontrolli- ja Rab24 hiljennettyjen solujen välillä olivat samanlaiset sekä täydessä kasvatusmediumissa että soluissa, joita oli nälkiinnytetty seerumi- ja aminohapottomassa mediumissa jopa 4 tunnin ajan. Autolysosomien sekä LAMP1/2-leimatun osaston tilavuus oli kuitenkin huomattavasti korkeampi Rab24 hiljennetyissä soluissa kontrollisoluihin verrattuna 6 tunnin nälkiinnyttämisen jälkeen. Kaiken kaikkiaan tulokset viittaavat siihen, että Rab24:ää ei tarvita autofagosomien muodostumiseen eikä kypsymiseen. Sen sijaan Rab24 saattaa toimia autolysosomien hajotuksessa pitkän seerumi- ja aminohappopaaston aikana.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Riina Honkanen gradu 2016.pdf 1.600Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record