Development of the CRISPR/Cas9 Method for Use in T. reesei

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201702131548
Title: Development of the CRISPR/Cas9 Method for Use in T. reesei
Author: Korppoo, Annakarin
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Department of Biosciences
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2017
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201702131548
http://hdl.handle.net/10138/175220
Thesis level: master's thesis
Discipline: Biotechnology
Biotekniikka
Bioteknik
Abstract: Trichoderma reesei, an anamorph of Hypocrea jecorina, is a filamentous fungus widely used for producing industrial enzymes. T. reesei is used for both endogenous and heterogenous protein production. The optimization of the production conditions and the effects of extracellular agents to T. reesei s production and secretion capacity are crucial for economically sustainable biotechnical production. The available carbon sources, most commonly different types of sugars, have a significant effect on the production and secretion of enzymes by T. reesei. Genetic modification of the pathways through which the fungi recognizes extracellular signals could bring advancements to industrial enzyme production. Because of T. reesei s potential and use as a production strain, the species is an interesting platform for genetic modifications that would enhance the production capacities. With the current methods the genome editing of T. reesei is however slow, and introducing multiple mutations to a single strain can take years. The aim of this study is to optimize the fairly new CRISPR/Cas9 genome editing system for use in T. reesei. In the CRISPR/Cas9 method, a catalytically active Cas9 enzyme is bound to a specific locus of the genome, guided by a guide RNA and the Watson-Crick base pairing principle. Once in the RNA-guided locus, Cas9 introduces a double stranded break in the DNA, which can be repaired by the cells endogenous non-homologous end joining pathways. This repair is error prone and produces mutations to site of the double stranded break. A donor DNA is often introduced together with the Cas9 and guide RNA. This donor DNA includes sequence homology to the site of interest and allows for the use of the cells homologous repair pathways. In this case, the mutation can be better controlled, and for example the risk of chromosomal mutations is reduced. Currently the CRISPR/Cas9 system is widely used in mammalian cell studies and up to 100% mutation frequencies have been reported in yeast cells. In this study the method is optimized for use in T. reesei. To our best knowledge, the research community has not found an organism in which CRISPR/Cas9 would not function. The question mainly lies on what type of set up and component introduction is suitable for each cell type and research purpose. In this thesis, three putative and one already published genes believed to be involved in hexose sugar sensing will be deleted from a T. reesei production strain with the help of CRISPR/Cas9. The effect of these deletions will be assessed through studying the secretion and activity of endogenous cellulases with enzymatic assays. One sugar transporter that may play a part in glucose sensing was identified in this study. The deletion of this transporter caused a decrease in cellulase production and/or secretion. The three other transporters or sensors did not have a significant effect on cellulase production in spent grain extract and lactose or glucose media. It s possible that these genes are involved in the uptake and use of other carbon sources. The continuous expression of the CRISPR/Cas9 system in T. reesei proved difficult. In the continuous expression method at least one of the CRISPR/Cas9 components, the Cas9 protein or the guide RNA, is produced in the cells in vivo. Neither was achieved in this study. Instead, a fully synthetic method in which the Cas9 is transformed into the cells as a protein along with an in vitro produced guide RNA was set up and produced up to 1000 × higher mutation frequencies when compared to the traditional transformation method used for T. reesei. This study also demonstrates a simultaneous deletion of two genes in T. reesei. To the best of our knowledge, multiple simultaneous gene modifications have never been achieved in T. reesei.Trichoderma reesei, Hypocrea Jecorinan suvuttomasti lisääntyvä muoto, on laajasti käytetty tuotantohome biotekniikassa. T. reeseitä käytetään sekä endogeenisten että heterogeenisten entsyymien tuotannossa. Tuotanto-olosuhteiden optimointi ja ulkoisten ärsykkeiden vaikutus T. reesein tuotto- ja erityskapasiteettiin on välttämätöntä taloudellisesti kannattavan bioteknisen tuotannon kannalta. Ympäristön hiilenlähteet, pääasiassa erilaiset sokerit vaikuttavat merkittävästi T. reesein entsyymituotannon tasoon. Hiilenlähteiden tunnistuksen säätely voisi tuoda ratkaisevia etuja tuotannollisesta näkökulmasta. Suuren tuotantopotentiaalinsa takia T. reesein biotekninen muokkaus on hyvin yleistä. Nykyisillä menetelmillä se on kuitenkin hidasta, ja usean mutaation tuottaminen samaan kantaan voi viedä vuosia. Tämän työn päämääränä on optimoida uusi CRISPR/Cas9 genominmuokkaus menetelmä T. reeseille sopivaksi. CRISPR/Cas9-menetelmä hyödyntää katalyyttisesti aktiivista Cas9-proteeinia ja ohjaajaRNAta, jonka avulla Cas9 proteiini voidaan ohjata haluttuun genomin lokukseen Watson-Crick emäspariutumisperiaatteen mukaisesti. Lokuksessa Cas9-proteiini saa aikaan kaksijuosteiden DNA-katkoksen, jonka solu voi korjata ei-homologisen DNA-korjauksen avulla. Tämä korjaus on usein virheellistä, ja tuottaa CRISPR/Cas9-kohdistettuun lokukseen mutaation. Menetelmän yhteydessä soluihin kuitenkin viedään yleensä kaksijuosteinen DNA-sekvenssi, jota voidaan käyttää Cas9:n tuottaman katkoksen korjaamiseen homologisella DNA-korjauksella. Tällöin syntyvää mutaatiota voidaan säädellä paremmin, ja esim. kromosomimutaatioiden riski pienenee. CRISPR/Cas9 on jo laajasti käytössä nisäkässolututkimuksissa, ja on tuottanut jopa 100% mutaatiofrekvenssejä hiivasoluissa. Tässä tutkimuksessa CRISPR/Cas9-menetelmä optimoidaan T. reeseille sopivaksi. Tutkimusyhteisö ei tiettävästi ole vielä löytänyt eliötä, jossa CRISPR/Cas9 ei toimisi. Kysymys on ennemmin siitä, millainen asetelma sopii kullekin solutyypille ja kuhunkin tutkimukseen. Tässä työssä T. reesein genomista poistetaan kolme ennustettua, ja yksi jo julkaistu, heksoosisokereiden tunnistukseen liittyvää geeniä CRISPR/Cas9 menetelmää käyttäen. Näiden poistogeenisten homeiden sellulaasientsyymien tuotantoa ja eritystä kasvatusliuokseen tarkastellaan entsymaattisten analyysien avulla. Tutkimuksessa löydettiin yksi sokeritransportteri, joka mahdollisesti tunnistaa glukoosin. Tämän transportterin poisto aiheutti sellulaasituotannon ja/tai erittymisen merkittävän vähentymisen. Kolmen muun transportterin ja/tai sensorin ei huomattu vaikuttavan merkittävästi sellulaasien tuotantoon rankkiuute-laktoosi- tai glukoosialustalla. On mahdollista, että nämä geenit kuitenkin vaikuttavat joidenkin toisten hiilenlähteiden tunnistukseen ja/tai käyttöön. CRISPR/Cas9-menetelmän jatkuvan tuotannon lähestymistapa osoittautui vaikeaksi T. reesein kohdalla. Jatkuvan tuotannon lähestymistavassa vähintään yksi CRISPR/Cas9 osatekijä, Cas9-proteiini tai ohjaajaRNA, tuotetaan soluissa in vivo. Tässä tutkimuksessa emme saaneet tuotettua onnistuneesti Cas9-proteiinia tai ohjaajaRNAta. Jatkotutkimuksia tarvittaisiin selvittämään miksi jatkuva tuotanto ei onnistunut. Täysin synteettinen menetelmä, jossa Cas9 siirretään soluihin proteiinina ja ohjaajaRNA synteettisenä RNA-molekyylinä johti jopa 1000 kertaa korkeampiin mutaatiofrekvensseihin tavanomaiseen transformaatiomenetelmään verrattuna. Tutkimuksessa pystyttiin myös osoittamaan, että kahden geenin samanaikainen poisto on mahdollista CRISPR/Cas9menetelmän avulla. Tämä on tiettävästi ensimmäinen kerta, kun useampaa geeniä on pystytty muokkaamaan samanaikaisesti T. reeseissä.
Rights: Publikationen är skyddad av upphovsrätten. Den får läsas och skrivas ut för personligt bruk. Användning i kommersiellt syfte är förbjuden.
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
developm.pdf 2.291Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record