Gramnegatiivisten bakteerien viestintä ja AI-2-välitteisen signaloinnin häirintä

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201705174157
Title: Gramnegatiivisten bakteerien viestintä ja AI-2-välitteisen signaloinnin häirintä
Author: Mäkkylä, Heidi
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Food and Environmental Sciences
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2017
Language: fin
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201705174157
http://hdl.handle.net/10138/191289
Thesis level: master's thesis
Discipline: Bioteknik (EYT)
Biotechnology (EYT)
Biotekniikka (EYT)
Abstract: Bakteerit kommunikoivat keskenään quorum sensing (QS) -ilmiön avulla. QS-ilmiössä bakteerit tuottavat ja vapauttavat ympäristöönsä pieniä molekyylejä, jotka toimivat signaalimolekyyleinä viestinnässä. Bakteerit käyttävät viestintää tilanteissa, joissa on hyödyllistä toimia koko bakteeripopulaation laajuisesti. QS-viestintä on tärkeässä osassa esim. virulenssitekijöiden ja biofilmien muodostuksessa. QS-viestintäjärjestelmiä on useita erilaisia. Gramnegatiiviset bakteerit käyttävät viestinnässään mm. AI-1-, AI-2-, AI-3- ja CAI-1-viestintäjärjestelmiä. Jokainen viestintäjärjestelmä perustuu kyseisen järjestelmän signalointimolekyylin konsentraation nousuun bakteerien ympäristössä sitä tuottavien bakteerien määrän kasvaessa. Signalointimolekyylin konsentraation noustessa tarpeeksi korkeaksi, aktivoituu signalointijärjestelmä, mikä johtaa sen alaisuudessa olevien geenien aktivoitumiseen. AI-2-järjestelmän oletetaan olevan universaali eli se toimii eri bakteerilajien välisessä kommunikoinnissa. AI-2-signalointijärjestelmässä bakteerit tuottavat 4,5-dihydroksi-2,3-pentaanidionia (DPD), joka toimii AI-2-järjestelmän signalointimolekyylinä. DPD:n kuljetus Escherichia coli ja Salmonella typhimurium -bakteerisolujen sisään tapahtuu ATP:tä sitovan ABC-tyyppisen kuljettajaproteiinin avulla. Bakteerisolun sisällä LsrK-kinaasientsyymi fosforyloi DPD-molekyylit, jotka tämän jälkeen sitoutuvat LsrR-säätelijäproteiiniin. LsrR toimii lsr-operonin vaimentimena operonin promoottorialueella ja fosforyloitujen DPD-molekyylien sitoutuminen irrottaa LsrR:n promoottorialueelta aktivoiden lsr-operonin geenit. Vibrio harveyin LuxP- ja LuxQ-proteiinit muodostavat bakteerin pinnalla proteiinikompleksin, joka tunnistaa DPD-molekyylit. DPD-konsentraation noustessa bakteerien ympäristössä, LuxPQ-kompleksi muuttuu kinaasista fosfataasiksi, mikä aikaansaa reaktioketjun jossa LuxU-fosfaatinsiirtäjä siirtää fosfaattiryhmän LuxO-säätelijäproteiinilta, jonka defosforylaatio vapauttaa LuxR-transkriptiotekijän toiminnan ja aktivoi AI-2-säädellyt geenit. Tämän työn tarkoituksena oli optimoida kaksi koetta, joita käytetään seulomaan yhdisteitä, jotka estävät AI-2-viestintää. Ensimmäinen koe oli bioreportteripohjainen koe, jossa käytettiin V. harveyi BB120 -bioreportterikantaa. Toinen koe oli entsyymipohjainen koe, jossa käytettiin työssä tuotettua LsrK-entsyymiä, jonka aktiivisuutta seurattiin ATP:n tai ADP:n määrää mittaavien testimenetelmien avulla. Optimoinnin kohteina olivat kokeissa käytettävät bakteeri-, LsrK- ja DPD-konsentraatiot. Lisäksi tutkittiin kokeiden dimetyylisulfoksiditoleranssia (DMSO) ja LsrK-kokeessa käytettyjen testimenetelmien stabiiliutta sekä LsrK-kokeessa käytettävää puskuriliuosta. Optimaatiokokeiden perusteella V. harveyi BB120 -kokeeseen valikoitui bakteerikonsentraatioksi 100000 pmy/ml ja DPD-konsentraatioksi 1 µM. LsrK-kokeen entsyymikonsentraatioksi valikoitui 300 nM ja DPD-konsentraatioksi 300 µM. DMSO:lla ei LsrK-kokeessa huomattu olevan vaikutusta ATP-konsentraatiota mittaavaan testipakkaukseen, mutta korkeimmat testatut DMSO-konsentraatiot vaikuttivat hieman ADP-konsentraatiota mittaavaan testipakkaukseen. LsrK-kokeeseen valittiin reaktiopuskuriksi trietanoliamiinia, magnesiumkloridia ja naudan seerumin albumiinia sisältävä puskuriliuos. Optimoidulla LsrK-kokeella suoritettiin seulonta synteettisille yhdisteille, joista ei kuitenkaan löytynyt osumia. Lisäksi optimoitua LsrK-koetta käytettiin erillisessä seulonnassa löytyneen AI-2-viestintää estävän yhdisteen, jota kutsutaan koodilla FIMM000642, annosvastekokeen suoritukseen. FIMM000642-yhdisteelle suoritettiin myös annosvastekoe glyserolikinaasientsyymiä vastaan, koska haluttiin tutkia vaikuttaako FIMM000642 toisen samaan proteiiniperheeseen kuuluvan kinaasin aktiivisuuteen vai onko se spesifinen estäjä LsrK:lle. FIMM000642 esti tulosten perusteella myös glyserolikinaasin toimintaa.Bacteria can communicate with each other using phenomenon called quorum sensing (QS). In QS the bacteria produce and release small signaling molecules which they use to communicate. Bacteria use QS in situations where it is beneficial to act on population level. QS has an important role e.g. in the formation of virulence factors and biofilms. There are several different QS systems. Gram-negative bacteria use i.a AI-1, AI-2, AI-3, and CAI-1 systems to communicate. All QS systems are based on the accumulation of signaling molecules when the bacterial concentration increases. When the concentration of signal molecules reaches the threshold level, the system activates. The activation of the signaling system then activates the expression of the genes controlled by the QS system. AI-2 signaling is assumed to be universal. That means that bacteria can use AI-2 signaling system in interspecies communication. In AI-2 signaling bacteria produce and release 4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione (DPD) which works as a signaling molecule in the AI-2 system. Escherichia coli and Salmonella typhimurium use an ATP binding cassette ABC-type transporter to transport DPD molecules into the cell where LsrK kinase phosphorylates the DPD molecules. The phosphorylated DPD molecules bind to the LsrR regulator protein which acts as a suppressor of the lsr operon. The binding of the phosphorylated DPD molecules releases the LsrR from the lsr promoter region enabling the expression of the lsr genes. In Vibrio harveyi the surface proteins LuxP and LuxQ form a protein complex that recognizes DPD molecules. When the DPD concentration increases, the LuxPQ complex transform from kinase to phosphatase and the reaction chain, where LuxU phosphate transfer protein transfers a phosphate group from LuxO regulator protein, activates. The dephosphorylation of of LuxO releases the LuxR transcription factor and activates the expression of QS controlled genes. The aim of this thesis was to optimize two assays which can be used to screen for compounds that disrupt AI-2 signaling. The first assay was a bioreporter based assay where V. harveyi BB120 bioreporter strain was used. The second assay was protein based LsrK assay where the LsrK activity was monitored using assay kit which measures the concentration of ATP or ADP. The concentrations of bacteria, LsrK, and DPD used in the assays were optimized. The dimethyl sulfoxide (DMSO) tolerance of both assays were tested, the stability of the kits used in the LsrK assays was tested and the reaction buffer for the LsrK assay was selected from the two tested buffer options. The selected bacterial concentration for the V. harveyi BB120 assay was 100000 CFU/ml and DPD concentration 1 µM. The selected enzyme concentration for the LsrK assay was 300 nM and DPD concentration 300 µM. The tested DMSO concentrations had no effect on the kit measuring ATP but the highest concentrations tested had a small effect on the kit measuring ADP. A buffer containing triethanolamine, magnesium chloride, and bovine serum albumin was selected as the reaction buffer for the LsrK assay. Using the optimized LsrK assay, a screening was performed for a synthesized compound library. None of the compounds showed any LsrK inhibiting activity. The optimized assay was also used to make dose-response experiment to one LsrK inhibiting compound, named FIMM000642, which was found in a separate screening. The FIMM000642 dose-response as-say was also done against glycerol kinase to see if the compound would inhibit another enzyme from the same protein family or if the compound was a specific inhibitor to LsrK. FIMM000642 inhibited also the activity of glycerol kinase.
Subject: AI-2
DPD
LsrK
Vibrio harveyi
quorum sensing
gramnegatiivinen bakteeri
kinaasiaktiivisuus


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record