Enzymes with radical tendencies : the PFL family

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:952-10-3401-7
Title: Enzymes with radical tendencies : the PFL family
Author: Lehtiö, Lari
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biosciences, Department of Biological and Environmental Sciences
Research Program in Structural Biology and Biophysics, Institute of Biotechnology, University of Helsinki
National Graduate School in Informational and Structural Biology
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2006-11-10
Language: en
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:952-10-3401-7
http://hdl.handle.net/10138/21921
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: The first glycyl radical in an enzyme was described 20 years ago and since then the family of glycyl radical enzymes (GREs) has expanded to include enzymes catalysing five chemically distinct reactions. The type enzymes of the family, anaerobic ribonucleotide reductase (RNRIII) and pyruvate formate lyase (PFL) had been studied long before it was known that they are GREs. Spectroscopic measurements on the radical and an observation that exposure to oxygen irreversibly inactivates the enzymes by cleavage of the protein proved that the radical is located on a particular glycine residue, close to the C-terminus of the protein. Both anaerobic RNRIII and PFL, are important for many anaerobic and facultative anaerobic bacteria as RNRIII is responsible for the synthesis of DNA precursors and PFL catalyses a key metabolic reaction in glycolysis. The crystal structures of both were solved in 1999 and they revealed that, although the enzymes do not share significant sequence identity, they share a similar structure - the radical site and residues necessary for catalysis are buried inside a ten stranded $\ualpha $/$\ubeta $-barrel. GREs are synthesised in an inactive form and are post-translationally activated by an activating enzyme which uses S-adenosyl methionine and an iron-sulphur cluster to generate the radical. One of the goals of this thesis work was to crystallise the activating enzyme of PFL. This task is challenging as, like GREs, the activating component is inactivated by oxygen. The experiments were therefore carried out in an oxygen free atmosphere. This is the first report of a crystalline GRE activating enzyme. Recently several new GREs have been characterised, all sharing sequence similarity to PFL but not to RNRIII. Also, the genome sequencing projects have identified many PFL-like GREs of unknown function, usually annotated as PFLs. In the present thesis I describe the grouping of these PFL family enzymes based on the sequence similarity and analyse the conservation patterns when compared to the structure of E. coli PFL. Based on this information an activation route is proposed. I also report a crystal structure of one of the PFL-like enzymes with unknown function, PFL2 from Archaeoglobus fulgidus. As A. fulgidus is a hyperthermophilic organism, possible mechanisms stabilising the structure are discussed. The organisation of an active site of PFL2 suggests that the enzyme may be a dehydratase. Keywords: glycyl radical, enzyme, pyruvate formate lyase, x-ray crystallography, bioinformaticsGlysyyliradikaalientsyymit (GRE:t) muodostavat proteiiniperheen, jonka jäsenet aktivoiduttuaan varastoivat radikaalin glysiini aminohappoon. GRE:t toimivat ainoastaan anaerobisissa eli hapettomissa olosuhteissa. Jos nämä entsyymit altistuvat hapelle, niiden aminohappoketju katkeaa ja entsyymi inaktivoituu. Eniten tutkitut GRE:t, anaerobinen ribonukleotidireduktaasi (RNRIII) ja pyruvaattiformaattilyaasi (PFL), ovat tietyille hapettomissa oloissa eläville organismeille välttämättömiä entsyymejä. RNRIII katalysoi reaktiota jota tarvitaan DNA:n valmistukseen. PFL puolestaan toimii mikrobin anaerobisessa energiantuotannossa. Sekä RNRIII:n että PFL:n rakenteet on ratkaistu ja ne muistuttavat toisiaan, vaikka niiden aminohappojärjestys on hyvin erilainen. Väitöskirjatyössäni olen tutkinut GRE:ejä röntgensädekristallografian ja bioinformatiikan menetelmin. PFL:n katalysoimassa reaktiossa pyruvaatin hiiliatomien välinen sidos katkeaa ja syntyy lopulta formaattia ja asetyylikoentsyymi A:ta. PFL:n kiderakenne yhdessä pyruvaatin kanssa paljasti, että pyruvaatti sitoutuu aktiiviseen keskukseen hyvin samalla tavalla kuin sen analogi oksamaatti. Oksamaatti on kuitenkin inertti, eikä toimi entsyymin varsinaisena substraattina eikä inhibiittorina. Onkin todennäköistä, että entsyymin aktivoiduttua eli radikaalin muodostumisen jälkeen, aktiivisen keskuksen konformaatio on muuttunut. Olisi tärkeää selvittää aktivoidun entsyymin kiderakenne, jotta rakenteen perusteella voitaisiin tehdä johtopäätöksiä entsyymin toimintamekanismista. Viime vuosien aikana tieto eri organismien perimästä on kasvanut valtavasti ja sen johdosta on löydetty uusia, emässekvenssin perusteella GRE:n kaltaisia geenejä. Väitöskirjatyössä vertailtiin tietokannoista löytyvien GRE:n kaltaisten entsyymien aminohappojärjestyksiä, ryhmiteltiin ne samankaltaisiin joukkoihin ja pyrittiin löytämään vakioisia alueita eri joukkojen sisältä sekä niiden väliltä. Saatua tietoa verrattiin aiemmin ratkaistuun PFL:n kiderakenteeseen. Vakioisten alueiden perusteella ehdotettiin mm. entsyymin aktivointireittiä, jonka kautta GRE:ä aktivoiva entsyymi pystyisi luomaan glysyyliradikaalin. Tietokannoista löytyvistä sekvensseistä löydettiin myös uusi aiemmin tunnistamaton GRE ryhmä, jonka jäsenet ovat merkittävästi pienempiä kuin aiemmin tunnetut entsyymit. Yksi tuntematon entsyymi, arkkibakteerin PFL2, valittiin tarkemman tutkimuksen kohteeksi, koska kyseinen arkkibakteeri, Archaeoglobus fulgidus, elää hyvin korkeissa lämpötiloissa, parhaiten 83 asteessa. A. fulgiduksen epätavallinen kasvulämpötila asettaa erityisvaatimuksia myös sen proteiineille, sillä näin korkeassa lämpötilassa proteiinit yleensä denaturoituvat. Korkean lämpökestävyyden takia PFL2 entsyymin glysyyliradikaalin voidaan olettaa olevan huoneenlämmössä stabiilimpi kuin PFL:n vastaava. Tämä saattaa mahdollistaa aktiivisen entsyymin rakenteen tutkimisen. Yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla A. fulgiduksesta monistettiin PFL2:ta koodaava geeni ja tuotettiin entsyymiä Escherichia coli-bakteerissa. Proteiini puhdistettiin, kiteytettiin ja sen rakenne ratkaistiin röntgensädekristallografian avulla. PFL2:n rakenne muistuttaa hyvin paljon yllä mainitun PFL:n rakennetta, mutta se on kuitenkin hieman lähempänä toisen GRE:n, hiljattain löydetyn glyseroli dehydrataasin (GD), rakennetta. PFL2:n kiderakenteessa aktiiviseen keskukseen on sitoutuneena pienmolekyyli, jonka elektronitiheys vastaa glyserolia. PFL2:n ja GD:n kiderakenteiden perusteella vaikuttaisi, että PFL2 olisi myös dehydrataasi, jonka substraatti on glyserolin kaltainen - ehkä hieman suurempi. Muista GRE:istä poiketen PFL2 on tetrameeri, joka koostuu kahden sijaan neljästä samanlaisesta alayksiköstä. Tällä on merkitystä entsyymin säätelyn kannalta, sillä yleensä ainoastaan toinen GRE:n alayksiköistä on aktiivinen. PFL2:n rakenteesta löytyi useita tekijöitä, jotka mahdollistavat entsyymin korkean lämpökestävyyden: mm. parempi aminohappojen pakkautuminen, suurempi määrä varauspareja, lyhyemmät silmukat ja niiden ankkurointi sekä ehkä myös suurempi alayksikköjen määrä. Avainsanat: glysyyliradikaali, entsyymi, pyruvaattiformaattilyaasi, röntgensädekristallografia, bioinformatiikka
Subject: biokemia
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
enzymesw.pdf 1.523Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record