Mu in vitro Transposition Technology in Functional Genetics and Genomics : Applications on Mouse and Bacteriophages

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:952-10-3100-X
Title: Mu in vitro Transposition Technology in Functional Genetics and Genomics : Applications on Mouse and Bacteriophages
Author: Vilen, Heikki
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biosciences, Department of Biological and Environmental Sciences
Institute of Biotechnology
Helsinki Graduate School in Biotechnology and Molecular Biology
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2006-05-05
Language: en
Belongs to series: URN:ISSN:1795-8229
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:952-10-3100-X
http://hdl.handle.net/10138/22090
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Transposons are mobile elements of genetic material that are able to move in the genomes of their host organisms using a special form of recombination called transposition. Bacteriophage Mu was the first transposon for which a cell-free in vitro transposition reaction was developed. Subsequently, the reaction has been refined and the minimal Mu in vitro reaction is useful in the generation of comprehensive libraries of mutant DNA molecules that can be used in a variety of applications. To date, the functional genetics applications of Mu in vitro technology have been subjected to either plasmids or genomic regions and entire genomes of viruses cloned on specific vectors. This study expands the use of Mu in vitro transposition in functional genetics and genomics by describing novel methods applicable to the targeted transgenesis of mouse and the whole-genome analysis of bacteriophages. The methods described here are rapid, efficient, and easily applicable to a wide variety of organisms, demonstrating the potential of the Mu transposition technology in the functional analysis of genes and genomes. First, an easy-to-use, rapid strategy to generate construct for the targeted mutagenesis of mouse genes was developed. To test the strategy, a gene encoding a neuronal K+/Cl- cotransporter was mutagenised. After a highly efficient transpositional mutagenesis, the gene fragments mutagenised were cloned into a vector backbone and transferred into bacterial cells. These constructs were screened with PCR using an effective 3D matrix system. In addition to traditional knock-out constructs, the method developed yields hypomorphic alleles that lead into reduced expression of the target gene in transgenic mice and have since been used in a follow-up study. Moreover, a scheme is devised to rapidly produce conditional alleles from the constructs produced. Next, an efficient strategy for the whole-genome analysis of bacteriophages was developed based on the transpositional mutagenesis of uncloned, infective virus genomes and their subsequent transfer into susceptible host cells. Mutant viruses able to produce viable progeny were collected and their transposon integration sites determined to map genomic regions nonessential to the viral life cycle. This method, applied here to three very different bacteriophages, PRD1, ΦYeO3 12, and PM2, does not require the target genome to be cloned and is directly applicable to all DNA and RNA viruses that have infective genomes. The method developed yielded valuable novel information on the three bacteriophages studied and whole-genome data can be complemented with concomitant studies on individual genes. Moreover, end-modified transposons constructed for this study can be used to manipulate genomes devoid of suitable restriction sites.Väitöskirjassa on kehitetty uusia menetelmiä, jotka hyödyntävät liikkuvia DNA-elementtejä eli transposoneja tutkimuksen apuna. Transposoni on pätkä DNA:ta, joka pystyy vaihtamaan paikkaa kromosomissa ja siirtymään kokonaan uuteen kromosomiin. Vaikka liikkuvia elementtejä on löydetty käytännössä kaikista tutkituista lajeista bakteereista ihmisiin, transposonien merkitys soluille on arvoitus. Elementit, jotka voivat vaihtaa paikkaa kromosomeissa, ovat vaarallisia, sillä siirtyessään uuteen paikkaan transposoni voi muuttaa tapaa, jolla kohdealueen geenit ilmentyvät tai mikä on tavallisinta kokonaan estää kohdealueen geenien ilmentymisen. Tästä voi seurata solujen kuolema tai hallitsematon kasvu. Toisaalta transposonit voivat siirtää ja monistaa isäntäsolujen kannalta hyödyllisiä geenejä uusiin paikkoihin. Yksinkertaisimman selityksen mukaan transposonit ovat genomin loisia, elementtejä, jotka ovat olemassa vain siksi, että ne pystyvät lisääntymään nopeammin kuin niitä ympäröivät DNA-alueet. Puhutaankin itsekkäästä DNA:sta. Uutta menetelmää varten transposoneja muokataan, jonka jälkeen niiden annetaan siirtyä bakteeriviruksista eristettyyn DNA:han. Näin tuotetaan suuri määrä mutanttiviruksia, joissa kaikissa transposoni sijaitsee eri kohdassa viruksen perimää. Tutkimalla sitä, mihin paikkoihin viruksen perimässä transposonit voivat kiinnittyä ilman että viruksen toiminta häiriintyy, saadaan tärkeää tietoa siitä, mitkä alueet viruksen perimässä eivät ole tai ovat välttämättömiä viruksen elinkierrolle. Näin saatua tietoa voidaan käyttää hyväksi, kun halutaan estää virusten leviämistä ja toimintaa. Projektissa tutkittiin kolmea virusta, jotka infektoivat eri bakteerilajeja, mutta menetelmää voidaan soveltaa myös useimpien kasvi- ja eläinvirusten tutkimiseen. Muuntogeeniset hiiret ovat keskeinen työkalu, kun halutaan selvittää ihmisen geenien toimintaa esimerkiksi perinnöllisten sairauksien yhteydessä. Muunneltujen geenien toiminta saattaa vaihdella huomattavasti riippuen siitä, mitä osaa geenistä on muokattu. Antamalla transposonien siirtyä tutkittavaan geeniin koeputkessa saadaan samasta geenistä suuri joukko erilaisia variaatioita, joissa kaikissa transposoni sijaitsee eri kohdassa geeniä. Näin muokatuista geeneistä valitaan mielenkiintoisimmat hiirimallien tekoa varten. Projektissa muokattiin KCC2-geeniä, jolla on keskeinen rooli hermostossa.
Subject: perinnöllisyystiede
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
muinvitr.pdf 784.4Kb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record