Developing a cell-based fluorescent assay for screening Dicer-activating compounds

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151401
Title: Developing a cell-based fluorescent assay for screening Dicer-activating compounds
Author: Parkkinen, Ilmari
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Pharmacy
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2018
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151401
http://hdl.handle.net/10138/234225
Thesis level: master's thesis
Discipline: Farmakologi
Pharmacology
Farmakologia
Abstract: MicroRNAs are ~22 nucleotide long RNA strands which regulate gene expression by binding to the 3’UTRs of messenger RNAs. MicroRNAs are predicted to regulate about a half of all protein-coding genes in the human genome thus affecting many cellular processes. One crucial part of microRNA biogenesis is the cleaving of pre-miRNA strands into mature microRNAs by the type III RNase enzyme, Dicer. Dicer has been shown to be downregulated due to aging and in many disease states. Particularly central nervous system disorders are linked to dysregulated microRNA processing. According to the latest studies, Dicer is crucial to the survival of dopaminergic neurons and conditional Dicer knockout mice show severe nigrostriatal dopaminergic cell loss, which is a hallmark of Parkinson’s disease. By activating Dicer with a small-molecule drug, enoxacin, the survival of dopaminergic cells exposed to stress is significantly improved. However, enoxacin, which is a fluoroquinolone antibiotic, activates Dicer only at high concentrations (10-100 μM) and is polypharmacological, which may cause detrimental side effects. Therefore, enoxacin is not a suitable drug candidate for Dicer deficiencies and better Dicer-activating drug candidates are needed. The aim of this work was to develop a cell-based fluorescent assay to screen for Dicer-activating compounds. Assays which measure Dicer activity have already been developed, but they have some pitfalls which don’t make them optimal to use for high-throughput screening of Dicer-activating compounds. Some are cell-free enzyme-based assays and thus neglect Dicer in its native context. The RNA to be processed by Dicer does not represent a common mammalian RNA type. Most assays do not have internal normalizing factors, such as a second reporter protein to account for e.g. cell death, or the analysis method is not feasible for high-throughput screening data. Considering these disadvantages, the study started by designing a reporter plasmid in silico. The plasmid expresses two fluorescent proteins, mCherry (red) and EGFP (green), and a mCherry transcripttargeting siRNA implemented into a pre-miR155 backbone which is processed by Dicer. Thus, measuring the ratios of red and green fluorescence intensities will give an indication on Dicer activity. The plasmid also has additional regulatory elements for stabilizing expression levels. The plasmid was then produced by molecular cloning methods and its functionality was tested with Dicer-modulating compounds. The assay was optimised by testing it in different cell lines and varying assay parameters, and stable cell lines were created to make large-scale screening more convenient. Finally, a small-scale screen was done with ten pharmacologically active compounds. Transiently transfected, in Chinese hamster ovarian cells, mCherry silencing was too efficient for reliable detection of improvement in silencing efficiency due to floor effect. With an inducible, Tet-On, system in FLP-IN 293 T-Rex cells, the expression could be controlled by administering doxycycline and the improvement in silencing was quantifiable. The assay seemed to be functional after 72 hours and 120 hours of incubation using enoxacin (100 μM) as a positive control. However, the screening found no compounds to significantly reduce mCherry/EGFP fluorescence ratio and, additionally, the effect of enoxacin was abolished. Therefore, a more thorough analysis on the effects of enoxacin was done and, although statistically significant, enoxacin was only marginally effective in reducing mCherry/EGFP fluorescence ratio after 72 hours of treatment. It should be noted from the small-scale screening that metformin and BDNF, compounds previously shown to elevate Dicer levels, showed similar effects to enoxacin. The quality of the assay in terms of high-throughput screening was determined by calculating Zfactors and coefficients of variations for the experiments, which showed that the variability of the assay was acceptable, but the differences between controls was not large enough for reliable screening. In conclusion, the effects of metformin and BDNF should be further studied and regarding the assay, more optimisation is needed for large-scale, high-throughput, screening to be done with minimal resources.MikroRNA:t ovat noin 22 nukleotidiä pitkiä RNA-juosteita, jotka estävät geenien ilmentymistä sitoutumalla lähetti-RNA:n 3’UTR-alueille. MikroRNA:t osallistuvat laajalti moneen soluprosessiin säätelemällä noin puolta kaikista proteiineja koodaavista geeneistä. MikroRNA:n ilmentymisessä, eräs tärkeä vaihe on III tyypin RNaasin, Dicerin, suorittama pre-miRNA:n prosessointi valmiiksi mikroRNA-juosteeksi. Dicerin toiminnan ja ilmentymisen on mitattu heikentyvän ikääntymisen johdosta, sekä useissa eri taudeissa. Erityisesti keskushermostotautien ja mikroRNA prosessointiin liittyvien ongelmien välillä on löydetty yhteys. Tuoreimpien tutkimusten mukaan Dicerilla on tärkeä rooli myös dopaminergisten hermosolujen selviytymisen kannalta ja lisäksi Dicer muuntogeenisillä hiirillä mustatumakkeen dopamiinihermosolut kuolevat, joka on Parkinsonin taudin keskeisin patofysiologinen ilmiö. Dicerin aktiivisuuden tehostamisella, käyttäen enoksasiinia, on suojaava vaikutus dopamiinihermosoluille. Enoksasiini, joka on fluorokinoloneihin kuuluva antimikrobinen yhdiste, tehostaa Diceria vain suurilla pitoisuuksilla (10-100 μM). Lisäksi se on polyfarmakologinen voiden aiheuttaa paljon vakavia haittavaikutuksia, joten se ei ole optimaalinen lääkeaine Dicer-puutoksiin liitettyjen tautien hoitamiseen. Tämän erikoistyön tavoitteena oli kehittää solupohjainen, fluoresenssiin perustuva menetelmä, jolla voisi seuloa parempia Diceria aktivoivia yhdisteitä. Dicerin aktiivisuutta mittaavia menetelmiä on jo kehitetty aiemmin muutamia, mutta ne eivät ole optimaalisia Diceria-aktivoivien yhdisteiden seulomiseksi. Osa kokeista on entsyymipohjaisia eivätkä ne ota huomioon solunsisäistä endogeenistä Diceria. Kokeissa käytettävä RNA, jonka Dicer prosessoi, ei edusta yleisiä nisäkässolujen RNA-tyyppejä. Tietyissä kokeissa ei ole sisäistä suhteuttavaa tekijää (esimerkiksi toista fluoresoivaa proteiinia) tai niillä ei ole mahdollista suorittaa laajoja seulontoja. Työssä suunniteltiin ensiksi edellä mainitut puutteet huomioon ottaen reportteriplasmidi in silico. Plasmidi ilmentää kahta fluoresoivaa proteiinia, mCherry:ä (punainen) ja EGFP:tä,(vihreä) sekä mCherry:n ilmentymistä estävää siRNA-juostetta pre-miR155:n runkoon liitettynä, jonka Dicer prosessoi. Näin ollen, mittaamalla punaisen ja vihreän fluoresenssi-intensiteettien suhdetta, voidaan tutkia Dicerin aktiivisuutta. Plasmidissa on myös useita säätelyelementtejä ilmentymisen tasaamiseksi. Plasmidi valmistettiin molekyylikloonausmenetelmin ja sen toiminnollisuutta testattiin Dicerin aktiivisuuteen vaikuttavilla yhdisteillä. Seulontakoetta optimoitiin eri solulinjoilla ja olosuhdemuutoksilla, ja lisäksi valmistettiin stabiileja solulinjoja laajamittaisen seulonnan helpottamiseksi. Lopuksi suoritettiin pienen mittakaavan seulonta kymmenelle farmakologisesti aktiiviselle yhdisteelle. Ohimenevästi transfektoituna, Kiinanhamsterin munasarjasoluissa, mCherryn hiljentäminen oli niin tehokasta, että hiljentämisen tehostamista ei voitu luotettavasti mitata. Hallitsemalla ilmentymistä doksisykliinin avulla, Tet-On-systeemillä FLP-IN 293 T-Rex soluilla, saatiin ilmentymistä kontrolloitua ja mittaukset luotettaviksi. Seulontakoe saatiin toimimaan 72 tunnin ja 120 tunnin aikapisteillä käyttäen enoksasiinia positiivisena kontrollina. Seulonnasta ei löydetty mCherry/EGFP fluoresenssien suhdetta merkitsevästi vähentäviä yhdisteitä ja lisäksi enoksasiinin vaikutus ei ollut enää tilastollisesti merkitsevä. Tämän perusteella suoritettiin laajempi analyysi enoksasiinin vaikutuksista, missä havaittiin, että sen vaikutus mCherry/EGFP fluoresenssien suhteen vähentämisessä oli, vaikkakin tilastollisesti merkitsevä, hyvin vähäinen 72 tunnin kokeessa. Huomioitavaa pienen mittakaavan seulonnasta on, että metformiinin ja BDNF:n, joiden on aiemmin osoitettu lisäävän Dicerin ilmentymistä, vaikutukset olivat vastaavia enoksasiinin vaikutukseen. Seulontakokeen laatu laajamittaisen seulontakokeen suhteen määritettiin laskemalla kokeille Z-tekijän sekä hajonnan koeffisienttien arvot. Nämä osoittivat, että kokeen hajonta oli hyväksyttävä, mutta ero kontrollien välillä oli liian pieni, jotta koetta voisi käyttää luotettavasti seulomiseen. Tärkeimpinä johtopäätöksinä, metformiinin ja BDNF:n vaikutuksia Diceriin tulisi tutkia tarkemmin, ja koetta on optimoitava lisää, jotta laajamittaisia seulontoja voidaan suorittaa mahdollisimman vähillä resursseilla.
Subject: dicer
RNA interference
microRNA
cell-based screening assay
fluorescent reporter
enoxacin
Parkinson’s disease
RNA interferenssi
mikroRNA
solupohjainen seulontakoe
fluoresenssireportteri
enoksasiini
Parkinsonin tauti


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
pro_gradu_parkkinen_ilmari.pdf 1.923Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record