Application of a novel molecular method for cancer diagnostics : detection of AR-V7 mRNA

Show full item record

Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201902121238
Title: Application of a novel molecular method for cancer diagnostics : detection of AR-V7 mRNA
Author: Elf, Sonja
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Faculty of Biological and Environmental Sciences
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2019
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201902121238
http://hdl.handle.net/10138/299032
Thesis level: master's thesis
Abstract: Huolimatta viimeaikaisista edistysaskelista syöpädiagnostiikan ja syöpähoitojen saralla, on tämä kompleksi ja monitahoinen tauti yhä yksi maailman yleisimmistä kuolinsyistä. Uusia ja nopeita diagnostisia menetelmiä tarvitaan syöpätautien tunnistamiseen niiden aikaisessa kehitysvaiheessa, jotta tautien aiempi prognoosi, parempi riskienhallinta ja tehokkaampi hoito olisivat mahdollisia. Kiinnostus spesifisiin molekulaarisiin biomerkkiaineisiin, jotka toimivat syövän tunnusmerkkeinä, on vähitellen kasvamassa. Näiden merkkiaineiden tunnistaminen nestemäisistä näytemateriaaleista kehittyneiden molekulaaristen diagnostiikkamenetelmien avulla tarjoaa huomattavia etuja perinteisiin onkologiassa käytettäviin kuvantamismenetelmiin verrattuna. Tämän tutkielman tavoite oli tutkia uuden molekulaarisen menetelmän, SIBA®:n (Strand Invasion Based Amplification), soveltuvuutta syöpämerkkiaineiden tunnistamiseen, sekä kehittää testi androgeenireseptorin silmukointivariantti 7 (AR-V7) mRNA:n tunnistamiseen. AR-V7:ä on esitetty hoitovaste-biomerkkiaineeksi potilaissa, joilla on metastaattinen kastraatioresistentti eturauhassyöpä (mCRPC). Tämän variantin ekspressio voi ilmaista kehittynyttä resistenssiä edistyneen eturauhassyövän hoitoon käytetyille hormonaalisille hoidoille. Eturauhassyöpä on maailmanlaajuisesti toiseksi yleisin miehillä esiintyvä syöpä keuhkosyövän jälkeen, ja se voi vähitellen kehittyä pitkälle edenneeksi kuolettavaksi metastaattiseksi kastraatioresistentiksi eturauhassyöväksi, johon androgeeni-deprivaatiohoito ei enää toimi. Positiivisen AR-V7-statuksen on esitetty edustavan tämän pitkälle edenneen eturauhassyövän fenotyyppiä, ja sen tunnistaminen voi auttaa sopivan hoitomuodon valinnassa mCRPC-potilaille. SIBA on uusi isotermaalinen menetelmä nukleiinihappojen monistamiseen ja tunnistamiseen. Teknologia tarjoaa merkittäviä etuja perinteiseen molekulaariseen tunnistusmenetelmään, polymeraasiketjureaktioon (PCR) verrattuna, sillä SIBA-monistus tapahtuu vakiolämpötilassa eikä vaadi lämpösykliseen monistamiseen tarvittavaa hienostunutta laboratoriovälineistöä. Käänteistranskriptio-SIBA (RT-SIBA) mahdollistaa RNA:n käänteistranskription cDNA:ksi samanaikaisesti cDNA:n monistuksen ja tunnistuksen kanssa yksivaiheisessa reaktiossa ja isotermaalisissa olosuhteissa. Menetelmä on osoittanut korkeaa analyyttistä herkkyyttä sekä spesifisyyttä kohdenukleiinihapoille. RT-SIBA-teknologiaa ei ole aiemmin sovellettu ihmisperäisen DNA:n tai RNA:n tunnistamiseen. Tämän tutkielman tärkein havainto oli, että RT-SIBA-teknologiaa voidaan soveltaa molekulaaristen syöpämerkkiaineiden, kuten AR-V7 mRNA:n, nopeaan ja spesifiseen tunnistamiseen. Tässä tutkimuksessa kehitettiin ja optimoitiin kaksi RT-SIBA-testiä, jotka kohdistuivat täyspitkän androgeenireseptori (AR-FL) mRNA:n sekä androgeenireseptorin silmukointivariantti 7 (AR-V7) mRNA:n tunnistamiseen. Näiden testien suorituskykyä arvioitiin testaamalla RNA:ta, joka oli eristetty AR-V7 positiivisista sekä negatiivisista eturauhassyöpäsoluista. Reaktiossa oli samanaikaisesti läsnä myös nestemäistä näytemateriaalia; kokoverta tai plasmaa. Kehitetyt RT-SIBA-testit olivat analyyttisesti erittäin spesifisiä ja herkkiä: ne monistivat alhaisia kopiomääriä kohde-mRNA:ta alle 20 minuutissa ilman epäspesifisten amplikonien muodostumista. Tulokset osoittavat, että RT-SIBA-teknologiaa voidaan hyödyntää AR-V7 ja AR-FL mRNA:n helppoon ja nopeaan tunnistukseen suoraan nestemäisestä näytemateriaalista ilman aikaa vievää näytteenkäsittelyä. Jatkokokeet todellisilla AR-V7-positiivisilla mCRPC-potilaiden kliinisillä näytteillä ovat tarpeellisia, jotta kehitetyt testit voidaan validoida luotettavasti.Despite recent advances in understanding, diagnosis and treatment of cancer, this complex and versatile disease remains one of the leading causes of death worldwide. New and rapid diagnostic methods are needed to detect cancers at their early stages of development, thus enabling earlier prognosis, better risk assessment and more efficient treatment of the disease. There has been an increasing interest in specific molecular biomarkers as the hallmark for cancer research, and the detection of these markers from liquid biopsies using advanced molecular diagnostics methods provides major advantages over the conventional imaging methods currently used in oncology. The aims of this thesis were to examine the applicability of a novel molecular method, SIBA® (Strand Invasion Based Amplification), for the detection of cancer biomarkers, and to develop an assay targeting androgen receptor splice variant 7 (AR-V7) mRNA. The AR-V7 is proposed as a treatment-response biomarker in patients with castration-resistant metastatic prostate cancer (mCRPC). The expression of this variant can indicate resistance to hormonal therapies used for the treatment of advanced prostate cancer. Prostate cancer is the most common cancer after lung cancer in men worldwide and can gradually develop into a highly advanced lethal form, mCRPC, that is not responsive to androgen deprivation therapies. Positive AR-V7 status is suggested to represent the phenotype of this advanced stage of prostate cancer, and its detection can assist in treatment selection for the mCRPC patients. SIBA is a novel isothermal method for the amplification and detection of nucleic acids. The technology offers significant advantages over the more conventional molecular detection method, polymerase chain reaction (PCR), since the amplification reaction occurs at constant temperature and does not require sophisticated laboratory equipment for the thermal cycling. Reverse transcription SIBA (RT-SIBA) enables reverse transcription of RNA to cDNA as well as the simultaneous amplification and detection of the cDNA in one-step reaction under isothermal conditions. The method displays both high analytical sensitivity and specificity to the target nucleic acids. The RT-SIBA technology has not formerly been applied for the detection of human DNA or RNA. The main finding of this thesis was, that the RT-SIBA technology can be applied for rapid detection of specific molecular cancer biomarkers such as the AR-V7 mRNA. In this study, two RT-SIBA assays targeting the full-length androgen receptor (AR-FL) mRNA and the AR splice variant 7 mRNA were developed and optimized. Performance of the assays were evaluated by testing RNA isolates from AR-V7 positive and negative prostate cancer cell lines in the presence of human whole blood and plasma in the reaction. The developed RT-SIBA assays provided high analytical sensitivity and specificity: low copies of the target mRNA were amplified within 20 minutes without the production of non-intended amplicons. The results suggest that the RT-SIBA technology can be utilized for easy and rapid detection of AR-V7 and AR-FL mRNA directly from liquid sample material without a need for time-consuming sample treatment. Further performance evaluation using real AR-V7 positive clinical samples from mCRPC patients is necessary for the reliable validation of the developed assays.
Discipline: biotekniikka
Biotechnology
bioteknik


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Elf_Sonja_Pro_gradu_2018.pdf 1.976Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record